Гибридизационный анализ ДНК с использованием биологических микрочипов

Федеральное агентство по образованию Пензенский государственный педагогический университет имени В. Г. Белинского Курсовая работа на тему:

Гибридизационный анализ ДНК с использованием биологических микрочипов Пенза 2010

Введение

Биологические микрочипы (biochips) или, как их чаще называют —microarrays, — это один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века. Изобретены биочипы были в конце 90-х годов в России и в США. Технология микрочипов — это принципиально новый уровень лабораторных исследований, так как она позволяет проводить одновременное тестирование тысяч образцов. Тысячи молекул ДНК или белков помещаются на стеклянные пластинки для создания ДНКи белковых чипов соответственно. На основании экспериментальных данных сотрудниками лаборатории клеточной инженерии под руководством д.б.н. Белецкого И. П. Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики (г. Пущино Московская обл.) была разработана технология для крупномасштабного изготовления стеклянных подложек при производстве ДНК_чипов, а также их использования при гибридизационном анализе ДНК. В его основе лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов. Биочипы используются для самых разных целей. В медицине биочипы помогают за считанные часы обнаруживать у больных лекарственно устойчивые формы туберкулеза и лейкоза, а так же некоторые виды раковых заболеваний. Биочипы являются незаменимым инструментом для биологов, которые могут сразу, за один эксперимент, увидеть влияние различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов.

1. Биохимические микрочипы Биохимические микрочипы, технологии производства и внедрения которых активно развиваются в России и за рубежом, являются сильнейшими из существующих инструментов для выявления и идентификации биологических материалов. В основе применения микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий нанесенных на подложку.

К главным причинам широкого распространения биочиповых исследований относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства. Биочипы применяются для обнаружения бактериальных и вирусных контаминаций в продуктах питания, косметике и окружающей среде, выявления генно-модифицированных организмов в пищевых продуктах, диагностики и прогнозирования различных заболеваний, детекции особо опасных инфекционных агентов в анти-биотеррористических целях и др.

1.1 ДНК-микрочипы ДНК-чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК-чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.

Впервые ДНК-чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.

ДНК-чип представляет собой твердую подложку, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие — 15−25 нуклеотидов, длинные — 25−60 нуклеотидов и кДНК фрагменты — от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото. Наиболее распространенные подложки — из стекла.

1.2 Белковые и пептидные чипы Для анализа продуктов трансляции генов используют чипы, построенных на основе полипептидов. Большинство лекарственных мишеней являются белками, следовательно, белковые и пептидные чипы могут быть полезны для поиска новых лекарств. Белковые микрочипы могут оказаться чрезвычайно полезными в медицине в качестве миниатюрных аналитических систем для определения иммунного статуса организма, выявления аллергической сенсибилизации и идентификации специфических аллергенов. Микрочипы, представляющие собрание основных антигенов главных патогенных организмов (бактерии, грибы и вирусы), позволяют анализировать образцы крови на присутствие одновременно сотен, тысяч антител и быстро идентифицировать инфекции. Большое значение в развитии белковых микрочипов имеют способы регистрации сигналов. К ним относятся: самый первый из известных методов — РИА (радиоиммунологический анализ), применяющий радиоактивную метку, иммуноанализ с использованием флуоресцентных меток — ФИА и иммуноферментный анализ (ИФА), в котором меткой является молекула фермента, ковалентно связанная с молекулой антитела. В качестве меток в ИФА выбираются высокоактивные стабильные ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.). Преимуществом ИФА является возможность многократного усиления сигнала. В последние годы разработаны чувствительные системы субстратов, дающих нерастворимые флуоресцирующие продукты, например, ELF-97. Очевидно, что процесс изготовления белкового микрочипа должен включать процедуру закрепления, иммобилизации на микрочипе. Выбор метода определяется многими параметрами — природой исходного субстрата, последующей областью применения микрочипа и т. д. Белковые микрочипы активно применяются, прежде всего, для анализа всех известных (и доступных) биологических жидкостей, включая сыворотку/плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость, слюну, слезную жидкость, амниотическую жидкость, и др. 13]

1.3 Углеводные микрочипы Многие природные биомолекулы (белки, липиды) модифицированы сахарными остатками. Часто биологические процессы включают связывание сахаров с рецепторами, и микрочипы могут стать важным инструментом в исследовании таких взаимодействий. Гликолипиды, нанесенные на нитроцеллюлозу или поливинилиденфторид, представляют пример углеводных микрочипов. Эти гликолипиды взаимодействуют с белками с известной углевод-связывающей специфичностью для подтверждения предсказанных олигосахарид-белковых взаимодействий. Связывание углеводов с мембранами регистрируют с помощью флуоресцентно меченых гликолипидов. Углеводный состав связавшегося компонента определяют in situ масс-спектрометрически. Важно отметить, что олигосахариды, связанные с липидом, могут иметь различное происхождение, например, гликопротеины, протеогликаны, гликолипиды, целые клетки и синтетические олигосахариды. Таким образом, по взаимодействию олигосахаридов, последовательность которых известна, с мембраной могут быть идентифицированы конкретные связанные с сахарами белковые мотивы. И, наоборот, путем связывания неизвестных олигосахаридов с мембраной можно отобрать белки с известной структурой, чтобы определить, с какими олигосахаридами они связаны. [10]

1.4 Тканевые микрочипы Данные по анализу экспрессии генов только начинают давать нам важную информацию о биологической функции генов, их потенциальном клиническом влиянии или их пригодности в качестве мишени для лекарства. В то же время традиционный гистологический анализ образцов ткани требует больших затрат времени: ткани выдерживают в формалине, помещают в парафин, делают срезы и только затем красят и проводят микроскопический анализ на индивидуальных стеклах. В 1998 году для такого анализа впервые были изготовлены тканевые микрочипы посредством нанесения на одну подложку многих образцов ткани. 9]

Изготовление микрочипа включает объединение до тысячи иголочных биопсий, взятых из помещенных в парафин образцов ткани, в парафиновом блоке с определенными координатами. Из этого блока делается до 300 срезов, которые переносятся на стекло для прокрашивания и анализа. Таким образом, из одного блока может быть произведено до 300 тысяч анализов. [11]При этом такой способ вызывает минимальное повреждение ткани.

Приготовленные один раз, микрочипы могут быть испытаны на взаимодействие с различными молекулярными мишенями — ДНК, РНК или белками — в сотнях или даже тысячах образцах ткани. Принципиальное отличие тканевых чипов от, например, ДНК_чипов заключается в том, что в последнем случае определяется экспрессия тысяч генов в одной ткани/образце, тогда как в первом — один ген в тысяче различных тканей/образцов. Преимущество анализа с использованием тканевых микрочипов состоит в том, что все образцы ткани обрабатываются одинаковым способом, т. е. концентрации реагентов, время инкубации, температура и состав растворов неизменны. При этом для анализа требуется всего десятые или сотые доли миллилитра реагентов.

Тканевые микрочипы довольно активно используются для поиска маркеров, ассоциированных с теми или иными заболеваниями, в первую очередь, с онкологическими. Показаны примеры успешного применения тканевых чипов для анализа аутоиммунных заболеваний [12], сердечной недостаточности, диабета и нейродегенеративных патологий.

2. Порядок проведения анализа ДНК с использованием биочипов Олигонуклеотидный зонд, модифицированный фосфатной группой по 5'-концу, пришивали к стеклу с помощью конденсирующего агента (карбодиимида в присутствии имидазола). Затем проводили гибридизацию с олигонуклеотидным фрагментом, меченным биотином, и цветную пероксидазную реакцию с помощью стрептавидин-пероксидазного конъюгата. По интенсивности окраски окисленного субстрата — диметиламинобензидина (ДАБ) — судили о результате анализа. [1]

2.1 Изготовление биологических чипов На основании экспериментальных данных была разработана технология для крупномасштабного изготовления стеклянных подложек при производстве ДНК_чипов. Для широкого применения чиповых технологий необходимы простые, дешевые и эффективные методы изготовления в больших масштабах и контроля модифицированных подложек, содержащих поверхностные аминогруппы. Наиболее часто используемыми твердыми подложками для изготовления микрочипов являются стекла, обработанные различными аминоалкилтриалкоксисиланами, например APTES (3-аминопропилтриэтоксисилан, Рис.3) для получения модифицированной поверхности.

б Рис. 3 Структурная формула APTES. а-в свободном состоянии, б-модифицированная на стекле [4]

Такая поверхность является гидрофобной и позволяет наносить зонды с максимальной плотностью. Как следует из литературных данных, условия получения амино-модифицированной стеклянной подложки могут быть весьма разнообразными. Это касается как концентрации APTES, так и выбора растворителя, который, в свою очередь, может содержать различное количество воды. Для изготовления амино-модифицированных подложек в больших масштабах желательно использовать как можно менее токсичные и дешевые растворители, такие как ацетон и этанол. Показано, что природа органического растворителя практически не влияет на качество получаемых стекол. Активация нуклеиновых кислот осуществляется при помощи карбодиимидов (CDI) — это один из ранних методов получения аффинных сорбентов, который до сих пор остается достаточно распространенным. В основе метода лежит способность карбодиимидов активировать концевую фосфатную группу нуклеиновых кислот. Активированные карбодиимидом олигонуклеотиды легко вступают в реакцию с аминоили сульфгидрильными группами носителей. К настоящему времени достаточно подробно изучен механизм активации карбодиимидами фосфатных групп олигонуклеотидов. Лимитирующей стадией реакции является протонирование карбодиимидов с образованием промежуточных неустойчивых реакционноспособных О_фосфорилизомочевины. Достаточно сильные нуклеофильные группы носителя могут ингибировать эту стадию[4]

Рис. 4 Механизм активации НК карбдиимидом. 4]

Кроме того, протонированные нуклеофильные группы не способны вступать в реакцию с соединениями 1 [Рис.4]. Вследствии этого выход конечного продукта 2 при использовании полимеров с высокоосновными группами может уменьшиться. Замещенные О-фосфорилизомочевины 3 способны также трансформироваться в побочные продукты, например гидролизоваться с высвобождением исходной фосфатной группы и мочевины, либо претерпевать ряд последовательных превращений с образованием пирофосфатов, полифосфатов и производных О-фосфорилизомочевины. Последние, в свою очередь, могут дать нереакционноспособные производные N_пирофосфорилмочевины 3 или N_фосфорилмочевины 4.

Для увеличения эффективности иммобилизации нуклеотидов на полимер активацию карбодиимидами проводят в присутствии нуклеофильного катализатора — имидазола, образующий соответствующий фосфамид олигонуклеотидов, который после протонирования остатков азола является высокореакционноспособным соединением по отношению к нуклеофилам. Чаще всего получаются фосфоимидазолиды 5 (Рис. 5)

Рис. 5 Механизм активации НК карбдиимидом в присутствии имидазола.[4]

Преимуществом этого подхода является отсутствие ряда побочных реакций, поскольку производное 5 стабильнее, чем О_фосфорилмочевина 1. Соединение 5 более эффективно взаимодействует с аминогруппой носителя, что способствует увеличению выхода при иммобилизации.

Проведение гибридизации.

В основе гибридизационного анализа лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов (Рис. 6,б). Известные в настоящее время реакции можно разделить на две большие группы. Первая группа методов основана на амплификации — циклически повторяющейся репликации in vitro искомого фрагмента ДНК (РНК). Амплифицированный фрагмент затем выявляется путем электрофореза в геле. Ко второй группе относятся методы прямого обнаружения специфической последовательности нуклеотидов (ДНК или РНК) при помощи коротких олигонуклеотидных одноцепочечных фрагментов, имеющих репортерную группу (зонд). Эти реакции получили название ДНК-зондирования. Их чувствительность зависит от вида используемого зонда и может быть весьма высокой. Наиболее распространенной нерадиоактивной репортерной группой, включаемой в состав олигои полинуклеотидных зондов, является витамин биотин (природный кофактор группы ферментов — карбоксилаз)(Рис 6, А) Рис. 6 Схема метода гибридизационного анализа на примере идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения. А — ПЦР с использованием праймеров меченных биотином (индекс «_мБ»);Б — гибридизация ПЦР продуктов со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологическом микрочипе (индекс «_и»)

нуклеотид чип гибридизационный пероксидазный Биотинилированное производное дУТФ (био-УТФ) включается в образуемые ДНК-полимеразами цепи вместо тимина и способно к комплементарным взаимодействиям с аденином.

Рис. 7. Структурная формула биотина. 15]

Биотин — соединение, стойкое к действию высоких температур, к кислой и щелочной среде, хорошо растворяется в воде и спирте. Он является коферментом во многих реакциях присоединения (карбоксилирования). Биотин легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами. В большом количестве биотин содержится в белках птичьих яиц, где он связан с гликопротеидом авидином, имеющим молекулярную массу 68 кДа. Биотин обладает чрезвычайно высоким сродством к авидину, а также к его бактериальному аналогу — стрептавидину (константа диссоциации комплекса биотин-авидин 10−15 М) и образуeт чрезвычайно стойкий комплекс (К_А=10¹⁵ моль^-1).

2.2 Проведение пероксидазной реакции Для проведения пероксидазной реакции используется коньюгат, состоящий из фермента, связанного со стрептавидином. Этот коньюгат образует очень прочный комплекс биотин-стрептавидин, который используется как связующий мостик между образовавшимся в ходе гибридизации дуплексом ДНК и ферментной меткой.

Наибольшее распространение в качестве ферментной метки получила пероксидаза хрена, которую впервые применили Накане и Пирс. Одна молекула фермента, конъюгированная со стрептавидином, способна «обработать» большое количество молекул субстрата. Под действием пероксидазы, субстрат H₂O₂ образует с красителем диаминобензидином (ДАБ) нерастворимый в воде и спирте комплекс коричневого цвета, который накапливается вокруг фиксированного дуплекса.

2.3 Обработка результатов анализа Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе для анализируемой пробы осуществляют с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа биологических микрочипов «EuroBioWto Биоконтроль» и компьютерной программы «MedGen». Полученную на экране компьютера гибридизационную картину для анализируемой пробы сравнивают с гибридизационной картиной для положительного контроля (заведомо трансгенной ДНК) и гибридизационной картиной для отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК). Пример схемы гибридизационной картины биологического микрочипа приведен на рис. 9.

Рис. 9 Пример схемы биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождяения. PC_положительный контроль, NC_отрицательный контроль, Lect-ген белка сои, Zein-ген белка кукурузы, Gus, Nos, 35s, Npt, Ocs-трансгенные последовательности Наличие яркого специфического окрашивания биологического микрочипа в местах, содержащих иммобилизационные олигонуклеотиды (для промоторов 35S и Nos, терминатора Ocs, генов Gus или NptII), свидетельствует о присутствии конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т. е. о трансгенности анализируемой ДНК. Отсутствие окраски после анализа указывает на отсутствие конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т. е. о нетрансгенности анализируемой ДНК. Наличие окрашивания NC cвидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты (1 моль/дм³), заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.

Анализ с использованием биочипов находит в настоящее время широкое применение на практике. Он отличается высокой чувствительностью, простотой процедуры выполнения, возможностью одновременного анализа множества параметров, специфичностью и воспроизводимостью. Применение биологических микрочипов может быть очень эффективно в таких сферах деятельности, как: обнаружение контаминации в продуктах питания и окружающей среде, диагностика и прогнозирование заболеваний, обнаружение элементов биологического оружия, оценка лекарственной эффективности. Разработка биочиповых технологий в РФ является одной из тех высоко-технологичных областей, которой уделяется особое внимание.

1. Шляпникова Е. А., Шляпников Ю. М., Афанасьев В. Н., Афанасьева Г. В., Гаврюшкин А. В., Белецкий И. П.. Исследование качества амино-модифицированных подложек, используемых для гибридизационного анализа.// Биоорганическая химия 2006 № 4 С.68−86.

2. Шляпникова Е. А., Шляпников Ю. М., Грановский И. Э., Афанасьева Г. В., Гаврюшкин А. В., Белецкий И. П. «Биологические микрочипы в медицине» Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

3. Timofeev E., Mirzabekov A. (1998) Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manifacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips and protein microchips. Anal.Biochem., 259, 34−41.

4. Шишкина И. Г., Левина А. С., Зарытова В. Ф. «Аффинные сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты и их фрагменты» //Успехи химии// 2001. № 70(6).С.581,.

5. Makretsov N.A., Huntsman D.G., Nielsen T.O., Yorida E., Peacock M., Cheang M.C., Dunn S.E., Hayes M., van de Rijn M., Bajdik C., Gilks C.B. (2004) Hierarchical clustering analysis of tissue microarray immunostaining data identifies prognostically significant groups of breast carcinoma. Clin Cancer Res., 10(18 Pt 1), 6143−6151.

6. Hu S., Loo J.A., Wong D.T. (2006) Human body fluid proteome analysis. Proteomics, 6(23), 6326−6353.

7. Ekins R.P. (1987) An overview of present and future ultrasensitive nonisotopic immunoassay development. Clin. Biochem. Revs. 8, 12−22.

8. Fukui S. et al. (2002) Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nat.Biotechnol.20, 1011−1017.

9. Kononen J. et al. (1998) Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumour specimens. Nat.Med. 4, 844−847/

10. Wang et al. (2002) Carbohydrate microarrays for the recognition of cross-reactive molecular markers of microprobes and host cells. Nat.Biotechnol.20, 275−281.

11. Perkel J.M.(2002) Tissue microarrays: advancing clinical genomics. The Scientist 21, 39.

12. Helmchen B., Weckauf H., Ehemann V., Wittmann I., Meyer-Scholten C., Berger I. (2005) Expression pattern of cell cycle-related gene products in synovial stroma and synovial lining in active and quiescent stages of rheumatoid arthritis. Histol Histopathol., 20(2):365−372.

13. Hueber W., Kidd B.A., Tomooka B.H., Lee B.J., Bruce B., Fries J.F., Sonderstrup G., Monach P., Drijfhout J.W., van Venrooij W.J., Utz P.J., Genovese M.C., Robinson W.H. (2005) Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum.; 52(9), 2645−2655.

14. Mobasheri A., Airley R., Foster C.S., Schulze-Tanzil G., Shakibaei M. (2004) Post-genomic applications of tissue microarrays: basic research, prognostic oncology, clinical genomics and drug discovery. Histol Histopathol., 19(1), 325−335.

15. Мелентьева Г. А. Фармацевтическая химия. Том 2, Москва «Медицина» 1976. С.68