Физико-химические исследования хлорофилла адсорбции

(Поступило 21 июня 1906 г.')

Уже давно известно, что различные, применяемые в качестве растворителей хлорофилла органические жидкости далеко не одинаково полно извлекают зеленый пигмент из листьев растений. В то время как спирт и эфир дают интенсивно окрашенные зеленые вытяжки, другие растворители, вроде алифатических или циклических углеводородов, а также и сероуглерод дают более желтоватые и вообще менее богатые хлорофиллом экстракты, даже тогда, когда вытяжка проводится с высушенным материалом. Наиболее характерно ведут себя в этом отношении петролейный эфир и петролейный бензин, которые из свежих или высушенных при низкой температуре листьев дают более или менее чистожелтые, окрашенные каротином вытяжки; как известно, на этом их свойстве Арно обосновал свой способ получения каротина из листьев.

Но если интегральный хлорофилл вполне растворим в петролейном эфире, как это все считают, то почему-^[1]

же этот растворитель не воспринимает его из свежих или высушенных листьев? Почему в раствор переходит только один желтый компонент?

Этот вопрос, далеко не безразличный для выяснения физического строения и химического состава хлорофильного аппарата, остается до сих пор неразрешенным. Блестящее развитие химии производных хлорофилла заслонило собой целый ряд значительно более интересных с физиологической точки зрения вопросов. Те немногие исследователи, которые обратили внимание на отмеченные нами явления, предложили различные, взаимно противоречащие объяснения, не обоснованные сколько-нибудь прочно экспериментально.

Первым из них надо отметить Визнера (1874), описавшего различие свойств бензола, толуола, скипидара и сероуглерода, как растворителей хлорофилла. Маститый венский физиолог отметил в то же время, что зеленая ткань листа, дающая при непосредственной обработке бензолом лишь желтоватую, слабо флюоресцирующую вытяжку, великолепно извлекается нацело тем же растворителем, если лист предварительно пропитать спиртом.

Визнер объясняет это непроницаемостью для бензола протоплазмы, не допускающей растворитель к хлорофиллу. Спирт же делает протоплазму проницаемой для бензола.

Согласные с этим наблюдения делает позднее Саксе{1877). .Так как бензол, сероуглерод и эфирные масла,—говорит он,—нерастворимы или почти нерастворимы в воде, то указанный прием (пропитывание объекта спиртом) имеет своей целью только проложить этим растворителям дорогу к хлорофильным зернам изгнанием из них воды. Из абсолютно сухих растительных частей все эти растворители будут растворять хлорофилл, надо полагать, так же хорошо, как и со спиртом*.

Карл Краус (1875) отмечает также, что бензин извлекает «з свежих или высушенных листьев лишь следы хлорофилла, следовательно, неизмененный хлорофилл нерастворим в бензине. Если же извлеченный при помощи спирта хлорофилл оказывается растворимым в бензине, то это указывает на химическое изменение пигмента под воздействием спирта.

Гинье (1885) считает, что хлорофилл заключен в листьях в нерастворимую для петролейного эфира оболочку.

Арно (1885) считает возможным объяснить элективное растворение пигментов листа петролейным эфиром (из высушенного материала) своеобразным анализом, при котором каротин свободно диффундирует, а «зеленые компоненты» задерживаются в листе растворенными в клеточном соке белковыми веществами наподобие процессов в красильном производстве.

Аналогичные краусовским химические представления находим мы в работах Манна (1891) и Монтеверде (1893). Последний автор приписывает модификаиионную роль спирту и хочет обосновать свои воззрения на том факте, что зеленые кристаллы Бородина, которые он считает за неизмененный хлорофилл, нерастворимы в петролейном бензине (и петролейном эфире).^[2]

Приведенным ограничиваются литературные данные, но нашей проблеме.

Переходя к экспериментальной проработке вопроса, я счел необходимым прежде всего ближе изучить воздействие различных индифферентных органических растворителей на пигменты листа in situ.

Из большого числа испробованных объектов особенно удачными оказались листья видов: Plantago и Lamium album. Нежность листьев Lamium и почти полная нейтральность их клеточного сока делают их особенно благодарным опытным объектом (ср. Molisch, 1904).

По отношению к пигментам листа испробованные растворители могут быть разделены на три группы.

• 1. Спирты (метиловый, этиловый, амиловый), ацетон, ацеталдегид, эфир, хлороформ. Все эти растворители при воздействии на свежие или высушенные листья извлекают равномерно и обильно все пигменты.
• 2. Петролейный эфир и петролейный бензин. Свежие тонко растертые с песком или наждаком листья при дальнейшем их растирании с растворителем дают более или менее чисто желтые вытяжки, окрашенные главным образом каротином, но содержащие и следы других пигментов Такой обработкой можно извлечь весь каротин нацело. Высушенные (при низкой температуре) листья также отдают растворителям свой каротин и даже в несколько более чистом виде. Прокипяченные или только нагретые до более высокой температуры ткани дают при растирании с указанными растворителями зеленые вытяжки; объяснение этому мы дадим ниже.
• 3. Бензол, ксилол, толуол, сероуглерод. Все эти растворители в своем воздействии на пигменты листьев занимают промежуточное положение между первыми двумя группами.

Как было сказано выше, петролейный эфир извлекает, помимо каротина, лишь следы других пигментов. Но достаточно прибавить к нему немного абсолютного спирта (10% для свежих и 1% для высушенных листьев), чтобы тотчас же получить густо окрашенные, прекрасные зеленые вытяжки. Также действуют ацетон и эфир.

При помощи спиртсодержащего петролейного эфира можно извлечь из листа нацело весь хлорофилл. На чем же основывается это «растворяющее» воздействие спирта? Так как одна из составных частей хлорофилла, именно каротин, отлично извлекается чистым петролейным эфиром, то нечего и думать о недоступности для растворителя хлорофилла. Точно так же здесь исключено и химическое воздействие спирта, как видно из следующих опытов. Свежие листья растираются с наждаком, и полученная влага смешивается с 40%-ным спиртом. Если эту смесь тотчас обработать петролейным эфиром, то получается зеленая вытяжка, но если смесь высушить при 45°, то петролейный эфир даст обычную желтую вытяжку каротина. Отсюда очевидно, что спирт действует исключительно своим присутствием, физически, а не химически. И действительно, извлеченные спиртом пигменты, безусловно растворимые в петролейном эфире, становятся в нем снова нерастворимыми.

Первые мои опыты в этом направлении (1901, III) былипроведены следующим образом. Петролейно-эфирно-спиртовые вытяжки хлорофилла наливались в колбу, в них бросались полоски фильтровальной бумаги, и растворитель отгонялся in vacuo, причем весь пигмент поглощался бумагой. Сухая зеленая бумага ведет себя по отношению к растворителям совершенно так же, как зеленый лист, и петролейный эфир извлекает из нее один лишь каротин, прибавление же спирта приводит к немедленному обесцвечиванию бумаги.

Отмеченные в начале этой статьи, остававшиеся до сих пор загадочными явления основываются, таким образом, на адсорбции пигментов, на механической, молекулярной связи этих веществ со стромой хлоропластов, которая может быть нарушена спиртом, эфиром и т. п., но не петролейно-эфирными углеводородами. Если же пигменты выходят из предела воздействия молекулярных сил, как, например, при кипячении или нагревании ткани,—причем, как известно, из хлоропластов выступают небольшие зеленые капельки (ср. Tswett, 1900), — то пигмент легко растворяется в петролейном эфире, и мы получаем интенсивно окрашенные зеленые вытяжки.

Из сказанного следует, что хлорофилл не может представлять микроскопически определенных частиц, включенных в хлоропласты, так как иначе эти частицы должны были бы иметь собственный нерастворимый адсорбирующий субстрат. Впрочем, гранулярная теория и микрографически далеко недостаточно обоснована (ср. Tschirch, 1884 и Tswett, 1896, 1901, III).

Выше было сказано, что внедренные в фильтровальную бумагу хлорофильные пигменты (за исключением каротина) прочно, а дсорбционно удерживаются субстратом в петролейнол! эфире. Наоборот, как и следовало ожидать, эти пигменты по глощаются фильтровальной бумагой из их раствора в петролей ном эфире. Но не только целлюлоза, а и все нерастворимые в петролейном эфире твердые тела адсорбируют хлорофилл и, примененные в виде тонкого порошка, обесцвечивают его растворы в петролейном эфире частично или нацело (Tswett, 1903). Я обследовал в этом отношении более ста различных химических веществ и всегда с принципиально одинаковым результатом. Приведу здесь краткий перечень испытанных веществ.

Простые тела (S, Si, Zn, Fe, Al, Pb, Sb); окислы (Si0₂ MgO, Mn0₂, PbO, SboO_s, Fe₂0₃, Ag_sO, HgO, U₃0₈); гидроокиси (B (OH)₃, NaOH, Ba (OH)₂, А1(ОН)₃); неорганические хлориды (Na, К, NH_1; Ca, Mg, AI, Fe, Co, Cu, Hg); хлораты (К, Ba) бромистый калий, йодистый калий; нитраты (К, Ca, Ba, РЬ, Ag, Си, U); фосфаты (К, Na, NH₄ Fe); сульфиды (К, Hg); сульфиты (Na); сульфаты (К, Ca, Mg, Ba, Zn, Fe, Mn, Си); карбонаты (Na, К, Mg, Fe); силикаты (К), асбест, молибдат аммония, перманганат калия, феррицианкалий и ферроцианкалий, щавелевая кислота, виннокаменная кислота, лимонная кислота, хинная кислота, дубильная кислота, мочевая кислота, пикриновая кислота, фенолфталеин, оксалаты (NH₄, Mg); ацетаты (Pb, Си); амиды (мочевина, аспарагин), высшие спирты и углеводы (маннит, дульцит, сахароза, галактоза, инулин, декстрин, крахмал); белковые вещества (яичный белок, пептон, гемоглобин), триоксиметилен, хлоралгидрат, гидрохинон, резорцин, пирогаллол, анилиновые краски (генцианавиолетт, хризоидин и др.) и, наконец, целый ряд химически не определяемых веществ (костный и кровяной уголь, полевая почва, трепел).

Некоторые из перечисленных веществ способны выделять из раствора в петролейном эфире и каротин (HgCi₂, СаСЦ, PbS и др.); многие вещества разрушают адсорбированные ими пигменты. Одни из них, как, например, Мп0₂" КМп0₄, U₃0₈, совершенно разрушают хлорофилл, очевидно путем окисления. Другие воздействуют на хлорофиллины, как кислоты; это, естественно, прежде всего большинство перечисленных кислот, кислые соли и многие нейтральные соли, в водных растворах гидролитически дающие кислую реакцию. Здесь не место ближе останавливаться на характере и сущности этих химических воздействий. Остановимся на методике адсорбционных опытов и их применении дли аналитических целей.

Для того чтобы получить раствор хлорофилла в петролейном эфире, удобнее всего поступать следующим образом. Свежие листья (лучше всего Lamium) растираются в ступке с тонким наждаком и затем экстрагируются содержащим 10% спирта петролейным эфиром. Зеленый раствор несколько раз промывается двойным объемом воды в разделительной воронке при постоянном взбалтывании.

Так как спирт гораздо легче растворяется в воде, чем в петролейном эфире, таким промыванием его можно практически целиком удалить из раствора хлорофилла. Промытая водой, обычно несколько мутная, вытяжка осветляется центрифугированием или фильтрованием и вполне годна для опытов с адсорбцией. '.

Как наиболее подходящие адсорбенты можно рекомендовать осажденный углекислый кальций, инулин или сахарозу (сахарная пудра).

При встряхивании петролейно-эфирной вытяжки хлорофилла с адсорбирующим материалом пигменты поглощаются им, и при некотором его избытке в растворе остается один каротин, не подвергающийся адсорбции. Этим путем получается зеленый осадок и чисто желтая, лишенная флуоресценции вытяжка каротина [пробу на флуоресценцию можно производить в моем люминоскопе (1901, II и 1906)]. Этот раствор каротина дает спектр с полосами поглощения 492—475 и 460—445 [/•(/. При взбалтывании этой вытяжки с 80%-ным спиртом нижняя, спирто-водная фаза остается совершенно бесцветной.

Зеленый осадок переносится на фильтр и тщательно промывается петролейным эфиром для удаления последних следов каротина. Отфильтрированную желтую жидкость можно мгновенно регенерировать при помощи костного угля. Осадок затем обрабатывается содержащим спирт петролейным эфиром, причем он вполне обесцвечивается и дает прекрасную зеленую вытяжку, которую можно подвергнуть разделению по Краусу с 80%-ным спиртом. В петролейно-эфирной фазе, синевато-зеленого цвета, содержатся главным образом хлорофиллины, а в нижней, желтой, растворены преимущественно ксантофиллы.

Если к петролейно-эфирному раствору хлорофилла прибавлять адсорбирующее вещество не в избытке, а понемногу,.

‘ Можно приготовить годную для опытов вытяжку и несколько более простым методом, положив листья на несколько минут в теплую (70—80°) водопроводную воду и затем, после растирания, экстрагировать чистым петролейным эфиром. При этом, однако, в растворе получаются некоторые дериваты хлорофиллинов, на которых мы здесь останавливаться не станем.

до исчезновения флуоресценции, то в растворе остаются вместе с каротином и ксантофиллы. Их можно очистить от каротина, обрабатывая раствор снова адсорбционным веществом и освобождая пигменты из их адсорбционного соединения при помощи спиртсодержащего петролейного эфира.

Полученная таким образом вытяжка смеси ксантофиллов дает полосы поглощения в спектре от 480 до 470 и от 452 до 440 (/-уПри взбалтывании с 80% спиртом пигменты переходят почти нацело в спиртовую фазу.

Физическое объяснение описанных адсорбционных явлений будет дано в другом месте. Но уже здесь отметим некоторые ведущие закономерности и вытекающие из них выводы. Насыщенный одним пигментом адсорбент может воспринять и удерживать некоторое количество другого. При этом возможны, однако, и замены. Так, например, ксантофиллы частично вытесняются хлорофиллинами из их адсорбционной связи, но не наоборот. Существует определенный адсорбционный ряд, по которому вещества могут замещать друг друга. Из этой закономерности вытекает следующее важное следствие. Если петролейно-эфирный раствор хлорофилла профильтровывать через столбик адсорбента (я применяю для этого главным образом углекислый кальций, плотно набитый в узкие стеклянные трубки), то пигменты по расположению их в адсорбционном ряду отлагаются отдельными окрашенными зонами по столбику сверху вниз, благодаря тому, что пигменты с более сильно выраженной адсорбцией вытесняют книзу слабее удерживаемые. Это разделение становится практически совершенным, если после пропускания вытяжки пигментов сквозь столбик адсорбента его промывать струей чистого растворителя. Как лучи света в спектре, в столбике углекислого кальция закономерно располагаются различные компоненты смеси пигментов, давая возможность своего качественного и количественного определения. Получаемый таким образом препарат я называю хроматограммой, а предлагаемую методику — хроматографической. Дальнейшее развитие ее я дам в одном из следующих сообщений. Быть может, не лишнее отметить и сейчас, что методика эта и по принципу своему, и по необыкновенной применимости и производительности ничего общего не имеет с так называемым капиллярным анализом.

Мы имели в виду до сих пор явления адсорбции хлорофильных пигментов из их раствора в петролейном эфире. Такие же явления можно наблюдать и с растворами пигментов в бензоле, ксилоле, толуоле и сероуглероде. Из бензольного раствора адсорбируются почти только одни хлорофиллины и значительно слабее, чем из петролейно-эфирного раствора. Адсорбция из раствора в сероуглероде выражена весьма резко, и раствор хлорофилла, приготовленный простым растиранием листьев в чистом растворителе, является прекрасным материалом для адсорбционных опытов, в особенности для хроматографического анализа. Различные окрашенные зоны в сероуглероде дают более насыщенную, блестящую окраску, чем в петролейном эфире, и в особенности ксантофиллы резко дифференцируются при этой обработкеКаротин же проходит насквозь в виде окрашенного в розовый цвет раствора.

Само собою разумеется, описанные явления адсорбции присущи не только хлорофильным пигментам; ясно, что самые разнообразные окрашенные или бесцветные химические соединения подлежат тем же закономерностям. До настоящего времени я изучил, со вполне положительным результатом, лецитин, альканнин, продигиозин, Судан, цианин, соланорубин и кислотные дериваты хлорофиллинов.

Варшава Институт физиологии растений университета.

Arnaud, А. (1885), Comptes rendus, 100, p. 751.

Borodin. J. (1882). Bot. Ztg., 40, S. 608.

G u i g n e t, Er. (1885). Compt., rend., 100, p. 434.

Kraus, K. (1875). Flora, S. 155.

Man n, G. (1891). Transact, of the Bot. Soc. Edinburgh, 18, p. 414. Molisch, H. (1904). Bot. Ztg., 62, I Abt., S. 5.

Montewerde, B. (1892). Acta Horti Petropolitani, 13, S. 124. Sachsse. R, (1877).Die CheroieundPhysiologiederFarbstoffeetc.Leipzig. Tschirch, A. (1884). Bot. Ztg., 42, S. 817.

Tswett, M. (1893). Arch. d. Sc. phys. et nat. Genfcve (IV), 2, p. 467. Tswett, M. (1900). Bot. Ztrbl., 81, S. 81.

Tswett, M. (1901) I. Compt. rend., 132, p. 149.

Ts w et t, M. (1901). II. Ztschr. f. phys. Chemle, 36, S. 450.

Tswett, M. (1901). III. Trav. de la Soc. d. Nat. de Kazan, 35.

Tswett, M. (1903). Trav. de la Soc. d. Nat. de Varsovie, XIV аппёе. Tswett, M. (1906). Ber. d. deutsch. Bot. Ges., 24, S. 234.

Wiesner, J. (1874). Sitzungsber. d. Wien. Akad., 69, I Abt., S. 327.

• [1] Berichte der deutschen botanischen Gescllschaft, 1906, Bd. 24, S. 316 — 323.
• [2] Я показал (1901), что эти кристаллы не представляют собой неизмененного пигмента, но являются дериватами хлорофиллинов. получаемыхпод продолжительным воздействием спирта, как это предполагал и самБородин (1882). Для этого пигмента я предложил название детахлоро-филлин. Подчеркну еще раз, что под хлорофиллом я разумею всю совокупность зеленых пигментов листа, обозначая зеленые более или менеефлуоресцирующие компоненты термином хлорофиллины. Необходимо, наконец, притти к точным, научным определениям.