Регуляция морфогенеза. 
Биотехнология растений

Хотя теоретически все клетки растений являются тотипотентными, реально далеко не все культуры могут дать начало новым растениям. Морфогенными культурами принято считать такие каллусные линии, которые способны к клеточной дифференцировке и образованию сложных дифференцированных структур (корни, почки, соматические зародыши) (рис. 1.7). Неморфогенными считаются каллусные культуры, не образующие четко выраженных дифференцированных структур или органов, т. е. неспособные к морфогенезу (рис. 1.8). Как правило, большей способностью к морфогенезу обладают первичные каллусы. Длительное культивирование часто вызывает потерю регенерационного потенциала. Однако в определенных условиях культивирования клетки могут оставаться тотипотентными на протяжении нескольких лет. Например, известна каллусная линия гороха, из которой были получены растения после 15 лет культивирования in vitro.

Рис. 1.7. Морфогенный каллус табака

Рис. 1.8. Каллус женьшеня, потерявший способность к морфогенезу

Способность культивируемых тканей к регенерации растений зависит от многих факторов:

• — вид и сорт растения, ткани которого введены в культуру;
• — орган или ткань, из которой получены экспланты;
• — физиологическое состояние растения — донора эксплантов;
• — состав питательной среды;
• — условия культивирования и др.

Каждый вид растения требует своих условий для запуска программы морфогенеза. У одних растений морфогенный каллус образуется с высокой частотой, из любых органов, и регенерацию растений осуществить легко. Характерным примером таких «удобных» видов являются представители семейства пасленовых. Значительно труднее получить морфогенные культивируемые ткани у однодольных растений. В начале 70-х годов XX века существовало мнение, что злаковые вообще не образуют способный к регенерации каллус. Однако затем были подобраны условия, и сейчас злаковые растения активно используются в биотехнологических программах. По-видимому, тотипотентность характерна для всех видов, и вопрос только в подборе адекватных питательных сред и «стимулов» индукции морфогенеза.

В зависимости от систематического положения различается и способ регенерации растений из культивируемых клеток: для одних (табак) побеги образуются путем органогенеза, для других (однодольные) — преимущественно через соматический эмбриогенез.

Для получения способного к регенерации растений каллуса имеет значение состояние дифференцировки ткани экспланта. У некоторых видов растений каллус можно получить практически из любого органа, у других — только из определенных частей. Легче всего получить морфогенный каллус из молодых тканей растения, богатых меристематическими делящимися клетками: апикальных и пазушных меристем, незрелых зародышей, базальной части молодых листьев. У древесных растений эффективно использовать только молодые побеги. Успехи в культивировании тканей и регенерации растений у злаковых были получены благодаря использованию в качестве эксплантов незрелых зародышей или пыльников, в то время как дифференцированные клетки листа не способны к дедифференцировке, а из клеток корня образуются только неморфогенные ткани. Зародыши некоторых видов, особенно злаковых, компетентны к образованию морфогенного каллуса только на определенной стадии развития.

На частоту образования морфогенного каллуса и регенерацию побегов влияют условия выращивания донорных растений: температура, влажность, условия освещения, минеральное питание.

Гормональная регуляция морфогенеза. Регенерационная способность культивируемых клеток в значительной степени зависит от состава питательной среды и, прежде всего, содержащихся в ней гормонов. Основными регуляторами роста каллуса и морфогенеза являются ауксины и цитокинины. Их роль в индукции органогенеза и соматического эмбриогенеза выше уже рассматривалась. Некоторые виды растений с готовностью откликаются на разные гормоны ауксинового ряда, например, морковь положительно реагирует на НУК, ИУК, 2,4-Д. Другие виды (злаковые и травы) чувствительны только к 2,4-Д. Реже используют такие ауксины как 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), пиклорам, 4-хлорфеноксиуксусная кислота, дикамба (3,6-дихлор-орто-анисовая кислота) и другие. Для многих культур требуется использование не одного, а нескольких ауксинов в одной среде. В качестве цитокининов для индукции морфогенеза чаще всего используют БАП в концентрации 0,1—5 мг/л. Для некоторых видов, например, хлопчатника, рекомендован тидиазурон — производное мочевины, обладающее цитокининовым действием. Эффективные концентрации гормонов лежат в пределах от 1 до 20 мкМ.

Кроме этих основных гормонов для индукции соматического эмбриогенеза используют гиббереллины — для ускорения созревания и прорастания соматического зародыша, и ингибитор роста — абсцизовую кислоту. Ее применяют в очень малых, неингибирующих концентрациях (0,1—1,0 мкМ) с целью предотвращения у соматических зародышей аномального развития семядолей, дополнительной пролиферации, вторичного соматического эмбриогенеза и преждевременного прорастания. В культуре тканей пшеницы, кукурузы, рапса АБК замедляла неорганизованный рост клеток и корнеобразование и стимулировала соматический эмбриогенез. Действие абсцизовой кислоты видои сортоспецифично: в одних случаях она усиливает соматический эмбриогенез, в других — ингибирует. Есть предположение, подкрепленное экспериментальными данными, что под действием экзогенной АБК снижается содержание эндогенной ИУК. Это, в свою очередь, вызывает изменение гормонального баланса, результатом чего становится изменение морфогенетической реакции клеток.

Явно ингибирующее действие на регенерационную способность культивируемых тканей оказывает этилен. Добавление в питательную среду для инициации каллуса предшественников этилена, например, 1-аминоциклопропанкарбоновой кислоты вызывало значительное уменьшение частоты образования эмбриогенного каллуса и сокращение числа полученных регенерантов. Включение в среду веществ, ингибирующих физиологическое действие этилена — норборнадиена или нитрата серебра, напротив, стимулировало образование эмбриогенного каллуса и повышало эффективность регенерации у большинства испытанных генотипов на 15—20%.

Негормональная регуляция морфогенеза. Среди негормональных компонентов среды важным регулятором морфогенеза является сахароза. Концентрации ее в питательной среде, рекомендованные для регенерации растений, варьируют от 2 до 12%. В зависимости от концентрации сахарозы в одной и той же культуре могут быть индуцированы либо органогенез, либо соматический эмбриогенез. Показано, что сахароза влияет на накопление культивируемыми клетками цитокининов и ауксинов. С другой стороны, сахароза может действовать как осмотически активное вещество. Добавление в питательную среду других осмотиков (сахарозы, маннита, сорбита, полиэтиленгликоля, NaCl или КС1 в низкой концентрации) ингибирует рост неморфогенного каллуса и стимулирует регенерацию растений. Возможно, частичное обезвоживание клеток в присутствии осмотиков индуцирует синтез АБК. В обоих случаях изменение концентрации сахарозы влияет на соотношение эндогенных гормонов, индуцируя различные морфогенетические реакции. Стимуляция соматического эмбриогенеза под действием осмотического стресса может иметь и другую интерпретацию: обезвоживание клеток вызывает частичный плазмолиз, что способствует изоляции клеток, индуцируя их к дифференцировке.

Большая роль в регуляции метаболизма отводится так называемым сигнальным молекулам, которые запускают каскад реакций, приводящих к изменению физиологического состояния клетки. В последнее время внимание исследователей все больше привлекают олигосахариды — фрагменты полисахаридов клеточной стенки растений или грибов. Вероятно, олигосахариды выполняют функции молекул-посредников в процессах межклеточной коммуникации, регулируя рост, развитие и выживание в неблагоприятных условиях. Биологически активные олигосахариды получили название олигосахарины.

Помимо состава питательной среды морфогенетический потенциал тканей in vitro во многом зависит от условий культивирования. Если рост недифференцированных клеток каллуса мало зависит от освещения, то для регенерации растений имеет значение не только наличие света, но и его спектральный состав. Например, у пшеницы незрелые зародыши, изолированные из растений, выращенных на синем свету, образовывали эмбриогенный каллус значительно чаще, чем зародыши, взятые от растений, росших на белом или красном свету. Импульсное облучение изолированных зародышей после помещения их на питательную среду светом разного качества также влияло на частоту образования морфогенного каллуса.

Генетическая регуляция морфогенеза. К сожалению, не существует универсальных питательных сред и условий культивирования, которые обеспечивали бы регенерацию растений из всех культур. Параметры, подобранные для одного вида или даже сорта оказываются неоптимальными для другого. Это ограничивает количество возможных объектов биотехнологии и вынуждает каждый раз заново подбирать условия регенерации растений. В одних и тех же условиях культивирования изолированные ткани разных сортов образуют морфогенный каллус с различной частотой. Например, у инбредных линий кукурузы доля зародышей, формирующих способный к регенерации растений каллус, варьировала в зависимости от генотипа от 0 до 80% (табл. 1.2).

Количество растений, которые можно получить от одного каллуса, также зависит от генотипа, при этом не всегда высокая частота каллусогенеза коррелируете высокой частотой регенерации растений.

Гибриды от скрещивания между собой линий с высоким и с низким морфогенетическим потенциалом демонстрируют сверхдоминирование и доминирование высокой способности к морфогенезу или промежуточное наследование. Наследуемость способности к морфогенезу дает возможность проведения селекции по этому признаку. В результате последовательного скрещивания гибридов F с морфогенной родительской формой можно повысить регенерационный потенциал в 2—3 раза. Гибридизация практически ценных, но низкоморфогенных линий с высокоморфогенными позволяет вовлекать их в биотехнологические программы.

Таблица 1.2

Частота образования морфогенного каллуса незрелыми зародышами разных линий кукурузы.

В то же время в некоторых гибридных комбинациях наблюдается полное подавление геномом одного из родителей способности к соматическому эмбриогенезу у гибридов. Вероятно, такие линии содержат супрессор регенерационного процесса, который может передаваться потомству.

Иногда морфогенетическая способность гибридов зависит от того, какое растение было использовано в качестве материнской формы. Например, в комбинации линий кукурузы Дкбб и А188 частота образования эмбриогенного каллуса равнялась 24%, если Дкбб была материнской формой, и 50%, если отцовской. Регенерационный потенциал аллоплазматических гибридов пшеницы различался в зависимости от того, цитоплазму какого из родителей они содержали. Частота образования эмбриогенного каллуса у фертильных линий кукурузы была выше, чем у линий с цитоплазматической мужской стерильностью, обусловленной генами митохондрий.

Значительные различия между генотипами по способности к морфогенезу in vitro, а также наследуемость этой способности указывают на существование генетической детерминации регенерационного потенциала. При этом весьма вероятно участие в регуляции морфогенеза не только ядерных генов, но и генов митохондрий.

Генетическая регуляция морфогенеза в настоящее время интенсивно изучается. Выявление ключевых генов, контролирующих компетентность клеток к регенерации растений, не только расширяет представления о механизмах дифференцировки клеток, но и дает возможность повышать морфогенетический потенциал методами генетической инженерии.

Для поиска генов, контролирующих процессы морфогенеза, и локализации их на генетических картах используют как классические генетические подходы, так и методы молекулярной генетики.

Гены, активирующиеся в процессе морфогенеза, можно условно разделить на несколько групп.

• 1. Гены, обеспечивающие активное деление клеток, необходимое для формирования меристематических очагов. Сюда относятся последовательности ДНК, контролирующие структуру хроматина; специфические факторы транскрипции и элонгации, усиливающие синтез определенных белков и т. п.
• 2. Гены ответа клеток на действие фитогормонов. Выявлен ряд генов, транскрипция которых начиналась под действием ауксина или цитокинина. Обнаружены последовательности, контролирующие уровень синтеза, рецепции, транспорта и разрушения этих гормонов. Преимущественно на поздних стадиях соматического эмбриогенеза под действием абсцизовой кислоты экспрессируются гены, кодирующие так называемые LEA (late embryogenesis abundant) белки, необходимые для перехода зародышей в торпедовидную стадию и дальнейшего созревания.
• 3. Гены, кодирующие ряд протеинкиназ, участвующих в сигнальных каскадах в процессе соматического эмбриогенеза.
• 4. Гены, кодирующие внеклеточные белки. Экспрессия этих генов играет важную роль как для индукции соматического эмбриогенеза, так и для развитии соматических зародышей. Предполагается, что кодируемые данными генами выделяемые из клеток ферменты глюконазы и эндохитиназы могут участвовать в разрушении компонентов стенок клеток, окружающих формирующийся соматический зародыш, что способствует его полноценному питанию за счет клеточного окружения. Возможно также, что эти ферменты способствуют высвобождению из клеточных стенок сигнальных молекул, необходимых для развития эмбриоида. В частности, показано, что внеклеточные арабиногалактановые белки являются сигнальными молекулами и участвуют в регуляции соматического эмбриогенеза на разных этапах.

Многообразие генов, так или иначе связанных с морфогенезом, свидетельствует о сложности и многоэтапности процесса регенерации растений из культивируемых in vitro клеток. Эта область исследований интенсивно развивается, и есть все основания надеяться, что в ближайшие годы генетические основы тотипотентности будут выяснены.

Таким образом, регенерация растений из культивируемых клеток зависит как от состояния самой клетки, детерминированного генотипом и называемого компетентностью, так и от внешних факторов. Компетентность клетки в значительной степени определяется количеством и соотношением эндогенных гормонов. Дифференцировка клеток в растения возможна при оптимальном сочетании внутренних и внешних регуляторов.