Значение прионов и вироидов в патологии человека

Кировская государственная академия Кафедра микробиологии с вирусологией и иммунологией Дисциплина «Микробиология, вирусология, иммунология»

РЕФЕРАТ Тема: Значение прионов и вироидов в патологии человека Выполнил:

Сиротин Е.С.

Студент группы Л-321

Проверил:

Коротаева К.Н.

Киров-2015 г.

Содержание Введение Глава 1. Прионы

1.1 Прионы — инфекционные агенты нового типа

1.2 Штаммы прионов

1.3 Механизмы прионного перехода

1.4 Прионные заболевания человека

1.5 Перспективы лечения прионных заболеваний Глава 2. Вироиды

2.1 Общие представления о вироидах

2.2 Классификация вироидов

2.3 Происхождение вироидов

2.4 Способность к репликации

2.5 PSTVd

Заключение

Список литературы Приложения

Введение

Несмотря на то, что в наше время медицина развивается с большой скоростью, в ней остается еще много тайн. Одной из таких тайн являются заболевания, вызываемые прионами. Прионы являются инфекционными агентами, устроенными проще, чем вирусы, но при этом способными вызывать инфекционные заболевания, которые на современном этапе развития медицины не поддаются лечению.

Другой инфекционный агент, имеющий крайне простую структуру, это вироиды. Однако для медицины вироиды не представляют особого интереса, так как вызывают заболевания только у растений.

В этом реферате мы подробно рассмотрим свойства и строение и прионов, и вироидов, так как оба этих инфекционных агента являются весьма интересными с точки зрения биологической науки.

Глава 1. Прионы

1.1 Прионы — инфекционные агенты нового типа Природа инфекционного агента, вызывающего прионные заболевания, долгое время оставалась неизвестной. В 1966 году было обнаружено, что агент, вызывающий скрэйпи, обладает необычными свойствами: устойчив к ионизирующей радиации и ультрафиолету. Это поставило под сомнение популярную в то время гипотезу о том, что скрэйпи вызывается вирусом. В 1967 году Д. Гриффит высказал предположение, что инфекционный агент не содержит генетического материала, а представляет собой измененную форму одного из клеточных белков, самоподдерживающуюся за счет автокаталитического механизма. В начале 80-х годов С. Прузинер с соавторами выделили и очистили агент, вызывающий скрэйпи, из мозга больных животных и описали его свойства. Выяснилось, что он устойчив к нагреванию, сохраняет активность после обработки протеиназой К, мочевиной, хаотропными солями, SDS и агентами, повреждающими ДНК-нуклеазами и псораленами. Было также обнаружено, что данный инфекционный агент чувствителен к ионизирующей радиации в присутствии кислорода, то есть проявляет свойства, характерные для гидрофобных белков, связанных с липидами. Агент, вызывающий скрэйпи, получил название «прион» (prion — proteinacious infectious particle). Этот агент представляет собой белок, названный PrP (Prion Protein). На основании определения первичной структуры белка PrP был идентифицирован кодирующий его ген, названный Prnp. Ген Prnp присутствует в геноме всех млекопитающих, а также у птиц и рыб. PrP является мембранным белком, который в основном экспрессируется в клетках центральной нервной системы и лимфоретикулярной ткани. Нормальная форма белка PrP обозначается PrPC. Патологическая форма этого белка, обуславливающая инфекционность, была названа PrPSc (форма PrP, связанная со scrapie). PrPSc неотличим от PrPC по аминокислотной последовательности, но имеет другую конформацию (рис.1). Пространственная структура рекомбинантного PrPC впервые была определена методом ядерного магнитного резонанса. Аминоконцевой район белка PrPC в растворе не структурирован, его карбоксиконцевая часть формирует глобулу и состоит из трех б-спиралей и короткого участка с в-структурой. Было обнаружено, что PrPC содержит 42% б-спиралей и 3% в-структур, тогда как PrPSc содержит 30% б-спиралей и 43% в-структур (рис. 2). Вследствие этого предположили, что приобретение инфекционных свойств белком PrP связано с конформационным переходом, при котором происходит образование в-складчатого слоя. В отличие от нормальной формы PrP, его патологическая форма устойчива к протеиназе К.

В результате обработки PrPSc протеиназой К образуется протеазоустойчивый фрагмент с молекулярной массой 27−30 кДа (молекулярная масса PrP варьирует от 33 до 35 кДа в зависимости от степени гликозилирования). Выявление протеазоустойчивого фрагмента PrPSc с молекулярной массой 27−30 кДа после обработки протеиназой К соскоба ткани миндалевидных желез до сих пор используется при диагностике прионных заболеваний.

На основании имевшихся к 1982 г. экспериментальных данных С. Прузинер сформулировал прионную концепцию. Эта концепция подразумевала следующее:

— инфекционным агентом является белок PrPSc,

— инфекционный агент PrPSc может реплицировать себя в отсутствие нуклеиновой кислоты,

— превращение белка из нормальной формы (PrPC) в инфекционную (PrPSc) происходит путем конформационного перехода,

— конформационный переход PrPC в PrPSc может происходить спонтанно, приводя к спорадическим формам прионных болезней. Он может быть вызван поступлением в организм патологической формы PrPSc извне (приобретенные формы прионных заболеваний). Наконец, переход может произойти из-за мутаций в гене Prnp, способствующих образованию PrPSc из PrPC (наследственные формы прионных заболеваний).

К настоящему времени концепция прионов получила убедительные экспериментальные подтверждения. Если размножение PrPSc после попадания в организм происходит путем наведения патологической конформации на PrPC, то организмы, лишенные PrPC, должны быть устойчивы к прионной инфекции. Это и было показано с использованием трансгенных мышей, гомозиготных по делеции гена Prnp (Prnp0/0).

Введение

гомогената мозга мышей, больных скрэйпи, трансгенным мышам Prnp0/0 не приводило к развитию болезни ввиду отсутствия нормального PrPC. Более того, оказалось, что в отсутствие PrPC не происходит не только репликации приона, но и повреждения нервной ткани. PrPC также необходим для транспорта инфекционного агента периферическими нервами к центральной нервной системе.

Окончательное доказательство концепции прионов долгое время сдерживалось невозможностью получения значительного количества PrPres — формы PrPSc, образуемой in vitro, которая устойчива к частичному протеолизу и способна вызывать болезнь при введении экспериментальным животным. Недавно было показано, что фрагмент рекомбинантного PrP мыши с 89 по 231 аминокислоту, экспрессированный в Escherichia coli, образует амилоидные фибриллы in vitro, которые при введении трансгенным мышам, экспрессирующим этот же фрагмент PrP, приводят к развитию неврологической картины прионного заболевания.

Разработка системы циклической амплификации прионной формы белка PrP, с помощью которой возможно формирование значительного количества PrPres in vitro, позволила получить и продемонстрировать ее инфекционность. Начальной матрицей для образования белка PrPres служил PrPSc — патологический белок из гомогената мозга хомяков, зараженных скрэйпи. Инкубация минимального количества PrPSc (гомогенат мозга хомяков, больных скрэйпи, разводили в 104 раз) с избытком PrPC приводила к образованию агрегатов PrPres. Агрегаты PrPres разрушали ультразвуком на более мелкие, разводили в 10 раз суспензией, содержащей избыток PrPC, и инкубировали снова. В результате много раз повторенного циклического процесса, включающего инкубацию PrPres с PrPC, разрушение агрегатов ультразвуком и последующее разведение, достигалось уменьшение содержания исходного инфекционного агента в реакционной смеси от 104 раз (в первом цикле) до 1055 раз (в заключительном). Образование PrPres в первом цикле происходило на матрице PrPSc, в последующих циклах превращению PrPC в инфекционную форму способствовал PrPres, полученный in vitro. Биохимические и структурные свойства PrPres оказались такими же, как свойства PrPSc, изолированного из мозга больных животных. Интрацеребральное введение PrPres здоровым хомякам индуцировало у них скрэйпи и приводило к смерти. Гистологический анализ мозга умерших животных показал губчатую дегенерацию нервной ткани, неотличимую от таковой у животных, зараженных PrPSc, образованным in vivo. Однако оказалось, что PrPres гораздо менее инфекционен, чем патологический белок, продуцируемый in vivo. Причины таких различий в инфекционности пока не выяснены.

Метод циклической амплификации прионного инфекционного агента эффективен для диагностики губчатых энцефалопатий человека, поскольку позволяет детектировать PrPSc в тканях и биологических жидкостях человека на ранних стадиях развития болезни.

Передача прионной инфекции между видами млекопитающих ограничена межвидовыми барьерами. Губчатые энцефалопатии передаются между особями одного вида или особям близкородственных видов. Например, болезнь Крейцфельда-Якоба передается от человека человеку, и от человека шимпанзе; скрэйпи же передается среди овец и коз, но не передается шимпанзе. Также неизвестны случаи заражения скрэйпи человека. В то же время межвидовые барьеры не абсолютны. Например, возможно заражение хомяков скрэйпи и коз болезнью Крейцфельда-Якоба. Межвидовые барьеры могут выражаться не столько в невозможности передачи инфекции животным отдаленного вида, сколько в удлинении инкубационного периода, а также в том, что заболевают не все, а какая-то часть экспериментально зараженных животных. Считается, что межвидовые барьеры вызваны различиями в первичной структуре PrP у млекопитающих разных видов. Подтверждением этому послужили следующие наблюдения. Трансгенные мыши, экспрессирующие PrP хомяка, оказались высокочувствительны к заражению прионами хомяка в отличие от мышей дикого типа. Передача болезни Крейцфельда-Якоба от человека мыши ограничена межвидовым барьером, однако трансгенные мыши, экспрессирующие PrP человека, подвержены заражению этой болезнью. Впоследствии выяснилось, что передача прионной инфекции ограничена не только отличиями в первичной структуре белка PrP, но и штаммовой принадлежностью приона.

1.2 Штаммы прионов Штаммовое разнообразие является одним из фундаментальных свойств прионов. Оно связано со способностью прионного белка приобретать и наводить различные прионные конформации. Последовательность аминокислот в белке PrP определяет набор конформаций, которые он может приобрести. Если наборы допустимых конформаций приона у двух различных видов организмов пересекаются, то может происходить преодоление межвидового барьера.

Размножаясь, белки PrP с различными конформациями обуславливают разницу в течении прионных заболеваний: возможны различные инкубационные периоды, клинические проявления, повреждения разных участков мозга. Впервые предположение о различных конформационных состояниях приона было высказано при исследовании лабораторных хомяков, зараженных двумя штаммами губчатой энцефалопатии норок: HY и DY. При введении хомякам эти два штамма приводили к различным инкубационным периодам и клиническим симптомам болезни. После частичного протеолиза PrPSc при помощи протеиназы К, выделенного из мозга хомяков, зараженных штаммами HY и DY, было обнаружено, что молекулярная масса протеазоустойчивого фрагмента приона HY на 2 кДа больше, чем молекулярная масса соответствующего фрагмента приона DY. Это означало, что у прионов HY и DY доступны для протеолиза разные участки полипептидной цепи PrP, и, следовательно, различие между штаммами заключается в разной пространственной укладке PrPSc. Было показано, что конформации белка PrP, соответствующие штаммам HY и DY, стабильно воспроизводятся in vitro. Инкубация PrPC с препаратами PrPSc, соответствующими штаммам HY и DY, приводила к превращению PrPC в PrPSc с двумя различными конформациями, типичными для штаммов HY и DY. Анализ вторичной структуры PrPSc штаммов HY и DY выявил, что они отличаются по характеру в-структур. Несколько штаммов PrPSc и соответствующих им фенотипов было идентифицировано в случае болезни Крейцфельда-Якоба.

Штаммы прионов стабильно поддерживаются in vivo. Это означает, что если заразить лабораторных животных разными штаммами PrPSc, то при развитии болезни у них будет поддерживаться именно тот штамм приона, которым их заразили.

В последнее время появились данные о возможной роли гликозилирования PrP в приобретении прионом штаммовой специфичности. PrP — это сиалогликопротеин, имеющий два сайта N-гликозилирования в карбоксиконцевом районе. Наряду с негликозилированной формой существуют монои дигликозилированные формы PrP. Анализ большого количества случаев болезни Крейцфельда-Якоба человека показал, что штаммы приона могут отличаться по степени гликозилирования PrPSc. Однако до сих пор неизвестно, каким образом гликозилирование влияет на конформацию и патологические проявления PrPSc.

1.3 Механизмы прионного перехода На сегодняшний день прионную гипотезу можно считать доказанной. Однако остается неясным механизм превращения PrPC в PrPSc. Было предложено несколько моделей прионного перехода. Согласно гетеродимерной модели, прионное состояние присуще мономеру белка PrP, и физическое взаимодействие PrPSc с PrPC катализирует превращение PrPC в PrPSc (рис. 3А). При этом спонтанный переход PrPC в PrPSc маловероятен из-за высокого энергетического барьера. После осуществления перехода PrPC в PrPSc образуются гомодимеры PrPSc/PrPSc, которые могут диссоциировать, запуская новые раунды конформационного превращения, или агрегировать. Наличие агрегированной формы белка не обязательно для прионного перехода и рассматривается как вторичное явление, не связанное с конформационной перестройкой как таковой. Существуют экспериментальные данные совместимые с этой моделью, но ее нельзя считать доказанной.

Альтернативный механизм прионного перехода рассмотрен в полимеризационной модели, согласно которой прионное превращение неотделимо от агрегации, так как прионную конформацию может стабильно поддерживать только олигомер или мультимер PrP.

Стадией, лимитирующей скорость перехода PrPC в PrPSc, является образование «ядра» — олигомера PrPSc, являющегося интермедиатом прионного превращения (рис. 3Б). Эта модель допускает существование двух возможных вариантов механизма прионного перехода.

Первый вариант прионного превращения предполагает, что PrPC и

PrPSc сосуществуют в термодинамическом равновесии, сдвинутом в сторону PrPC, и PrPSc образуется до присоединения мономера PrP к «ядру». Стабилизация состояния PrPSc происходит при присоединении мономера PrPSc к «ядру» PrPSc, в результате чего мономер PrPSc оказывается в составе полимера PrPSc. Если мономер PrPSc не присоединяется к «ядру» PrPSc, происходит обратное превращение PrPSc в PrPC.

Второй вариант полимеризационной модели предполагает, что конформационная перестройка происходит в момент присоединения мономера PrPC к олигомеру PrPSc, а не до этого. В пользу полимеризационной модели свидетельствуют эксперименты, показавшие, что конвертирующая активность связана именно с полимерами PrPSc.

Позднее была предложена модель прионного перехода, представляющая собой второй вариант полимеризационной модели с дополнительными допущениями. Было показано существование интермедиатов прионного превращения — олигомерных комплексов, менее структурированных, чем прионные фибриллы и напоминающих мицеллы.

Для того, чтобы такой олигомерный комплекс мог катализировать прионный переход, он должен сформировать стабильное «ядро», обладающее прионной конформацией. Конформационному превращению может подвергаться как мономер, так и олигомерный комплекс при присоединении к стабильному «ядру», служащему «матрицей» для образования прионной конформации.

инфекционный прионный заболевание вироид

1.4 Прионные заболевания человека Куру (папуасское curu — дрожать, трястись) впервые описано в 1957 г. К. Гайдушеком у папуасов-каннибалов в Новой Гвинее. Характеризуется прогрессирующей мозжечковой атаксией, общим дрожанием, адинамией, а также психическими изменениями (эйфория, беспричинный смех и т. п.).

Болезнь Крейтцфельда—Якоба (БКЯ — дегенерация кортикостриоспинальная) встречается повсеместно. Характеризуется прогрессирующей деменцией с симптомами поражения пирамидальных и экстрапирамидальных нервных путей. В 1996 г. началась эпизоотия губкообразной энцефалопатии коров («бешенство» коров) в Англии, а затем в ряде других стран Западной Европы. Она связана с нарушением природных схем питания животных: они стали получать в виде добавок к пище вещества, полученные из костей и мясных отходов овец и коров. Заражение мясом таких животных стало причиной заболевания людей БКЯ. В Англии описана новая форма БКЯ (она обозначена как VCJD). Она отличается от БКЯ тем, что ею болеют лица моложе 40 лет, а также более длительным течением и развитием нейропатологических изменений, не наблюдаемых при классическом течении болезни.

Летальная семейная бессонница — потеря сна, гиперреактивность симпатической системы, прогрессирующее ослабление автономных и эндокринных циклических временных ритмов; наблюдается у лиц среднего возраста (около 45 лет).

Синдром Герстманна—Штрейслера (СГШ) — медленная инфекция. Зарегистрирована в Великобритании, США, Японии и других странах мира. Характеризуется дегенеративными поражениями ЦНС, которые проявляются в формировании губкообразного состояния, образовании амилоидных бляшек во всем мозге. Болезнь выражается в развитии медленно прогрессирующей атаксии и деменции. Патогенез не изучен. Заболевание тянется длительно и заканчивается смертью.

Амиотрофический лейкоспонгиоз — медленная инфекция человека, характеризующаяся прогрессирующим развитием атрофических парезов мышц конечностей и туловища, нарушением дыхания и заканчивается смертью.

Синдром Альперса — медленная прионная инфекция. Наблюдается главным образом в детстве, характеризуется симптомами, свидетельствующими о поражении ЦНС.

Для прионных болезней человека характеры 4 классических нейропатологических признака: спонгиозные изменения (множество овальных вакуолей диаметром 1—50 мкм в сером веществе мозга), потеря нейронов, астроцитоз и формирование амилоидных бляшек.

Предполагается, что прионы играют роль в этиологии шизофрении, миопатии и некоторых других заболеваний человека.

К. Гайдушек в 1976 г. за открытие инфекционной природы прионных болезней и С. Б. Прузинер в 1997 г. за открытие прионов и разработку прионной теории были удостоены Нобелевских премий.

1.5 Перспективы лечения прионных заболеваний В настоящее время прионные болезни считаются неизлечимыми, однако подходы к их лечению активно разрабатываются. Губчатые энцефалопатии характеризуются отсутствием иммунного ответа на прионную инфекцию. Это связано с тем, что нормальная форма PrP всегда присутствует в организме, и в том числе в Tи B-лимфоцитах. Однако in vitro было показано, что антитела против нескольких эпитопов PrP ингибируют размножение PrPSc. Вакцинация рекомбинантным PrP перед инфекцией или сразу после нее и пассивная иммунизация антителами против некоторых эпитопов PrP приводили к ингибированию репликации приона и отсрочке заболевания. Эти эксперименты подтвердили эффективность вмешательства в иммунную систему при лечении прионных заболеваний. Размножение PrPSc может быть остановлено с помощью «блокаторов в-структур» — пептидов, обогащенных пролином и имеющих гомологию с PrPC. Существует и другой подход, основанный на полиморфизме гена Prnp. Известно, что замены Q171R в белке PrP овец и E219K в PrP человека несовместимы с образованием прионной формы PrPSc. Мутации, приводящие к данным аминокислотным заменам в PrP овец и человека, были введены в ген Prnp мыши. Соответствующие рекомбинантные мутантные белки мыши не переходили в патологическую изоформу PrP, а также ингибировали формирование PrPSc в клеточных культурах дикого типа. Данные мутации имели доминантно-негативное проявление, поскольку препятствовали переходу нормального белка PrP мыши в прионное состояние.

Для того чтобы использовать доминантно-негативные мутанты PrP в генотерапии прионных заболеваний, были разработаны лентивирусные векторы для доставки кодирующей их ДНК in vivo. В культурах нейронов мыши показано, что трансдукция клеток лентивирусными вирионами, содержащими описанные выше мутантные аллели Prnp, приводит к значительному снижению уровня PrPSc.

Дрожжи представляют собой удобную модель для поиска и изучения факторов, способных излечивать клетки от прионов. PrP млекопитающих при экспрессии в клетках дрожжей, по всей видимости, имеет тенденцию к переходу в прионную форму, поскольку накапливается в агрегированной и протеазоустойчивой форме. Дрожжи, содержащие прион PrPSc, могли бы быть использованы для поиска лекарственных препаратов с антиприонными свойствами, однако такие работы пока не проводились либо еще не опубликованы.

Глава 2. Вироиды

2.1 Общие представления о вироидах Название «вироид» было предложено в 1971 г. Т.Динером. Оно свидетельствует о том, что симптомы заболеваний, которые вызывают эти агенты у различных растений, похожи на симптомы заболеваний, вызываемых у них вирусами. Однако вироиды отличаются от вирусов по крайней мере по следующим четырем признакам.

1. Вироиды, в отличие от вирусов, не имеют белковой оболочки и состоят только из инфекционной молекулы РНК. Они не обладают антигенными свойствами и поэтому не могут быть обнаружены серологическими методами.

2. Вироиды имеют очень малые размеры: длина молекулы РНК вироидов равна 1 * 10−6 мм, она состоит из 300—400 нуклеотидов. Вироиды — самые маленькие способные к размножению единицы, известные в природе.

3. Молекулы вироидов представляют собой одноцепочечные кольцевые РНК. Такую кольцевую структуру имеет еще только один вирус — вирус дельта-гепатита.

4. Молекулы РНК вироидов не кодируют собственных белков, поэтому их размножение может происходить либо аутокаталитически, либо с участием клетки-хозяина.

2.2 Классификация вироидов Классификация вироидов основана на анализе нуклеотидной последовательности. Если уровень гомологии выше 90%, то сравниваемые вироиды считаются одного вида. Различают два семейства Pospiviroidae и Avsunviroidae. Названы по сокращению первых найденных представителей: Potato spindle tuber viroid (PSTVd) и Avocado sunblotch viroid (ASBVd). Pospiviroidae отличается наличием центральной консервативной части и отсутствием в составе генома рибозимов типа hammerhead. Avsunviroidae напротив не имеют центральной консервативной части, но обладают в составе генома рибозимами типа hammerhead. Pospiviroidae, как правило располагаются в ядре клетки генома-хозяина, а Avsunviroidae в хлоропласте.

2.3 Происхождение вироидов По одной из версий, считается, что вироиды представляют собой «сбежавшие интроны» — вырезанные в ходе сплайсинга незначащие участки мРНК, которые случайно приобрели способность к репликации. Белков вироиды не кодируют.

Вироиды так же рассматривают в качестве представителей добиотического «мира РНК», неких эволюционных реликтов.

2.4 Способность к репликации У семейства Avsunviroidae способность к репликации имеется благодаря наличию в геномной РНК, кода рибозима типа hammerhead, как правило в двух вариантах с разных сторон (RZ+, RZ-).

2.5 PSTVd

Первым идентифицированным вироидом был вироид клубней картофеля (англ. PSTVd, potato spindle tuber viroid). Первичная и вторичная структура этого вироида представлены на данных рисунках (рис.4а и 4б).

Заключение

В заключение можно сделать вывод о том, что хоть и на данном этапе развития науки заболевания, вызываемые прионами и вироидами, не поддаются лечению, все же есть предпосылки к продвижению в том направлении. Одной из таких предпосылок является подробное изучение структуры этих инфекционных агентов, что в будущем должно помочь при создании методов борьбы с ними. Так же изучение прионов и вироидов имеет особую научную ценность, так как их свойства в будущем могут быть использованы на благо человечества. Но пока что нам предстоит еще очень много узнать об этих необычных явлениях природы.

1. И. С. Шкундина, М.Д.Тер-Аванесян. Прионы. Успехи биологической химии, т. 46, с. 3−42. М.: ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росздрава, 2006 г.

2. medicalbrain.ru

3. С.Г.Инге-Ветчомов, В. М. Адрианова. Генетика 6. М., 1970 г

4. ru.wikipedia.org

5. М.Д.Тер-Аванесян, А. Р. Дакеаманская, В. В. Куширов, В. Н. Смирнов. Генетика.М., 1994.

Приложения Рисунок 1. Нормальный и патогенный прионный белок.

Рисунок 2. Соотношение б-спиралей и в-структур в нормальном и патогенном прионом белке.

Рисунок 3. Модели прионного перехода.

А — гетеродимерная модель.

Б — два варианта полимеризационной модели. Образование «ядра» PrPSc происходит медленно, процесс полимеризации — быстро.

Рисунок 4. Первичная и вторичная структура вироида PSTVd.

А — первичная структура.

Б — вторичная структура.

А.

Б