Получение фракции генов 16S рРНК (16S рДНК)

На этом этапе, как и на предыдущем, решается критическая для всего анализа задача — полнота представления генов 16S рРНК (16S рДНК) каждого из членов сообщества в суммарной фракции этих генов. Для получения суммарной фракции 16S рДНК используют три основных способа.

• Получение и скрининг библиотеки клонов. В данном случае применяется широко распространенная в биоинженерии технология получения рекомбинантных ДНК («shortgun»). Полный набор образовавшихся в результате рестрикции эндонуклеазами ферментов ДНК встраивают в плазмидный или фаговый вектор, а затем клонируют в клетках Е. coli.

Последующий скрининг полученной библиотеки позволяет выбрать из нее все клоны, содержащие полноразмерные вставки генов 16S рРНК. Эта технология наиболее сложна в исполнении, однако позволяет полнее других отобрать все представленные в суммарной ДНК гены 16S рРНК.

• • Проведение прямой ПЦР. Этот более простой, а поэтому и самый распространенный способ дает возможность получать ПЦРамплификаты генов 16S рРНК из суммарного препарата ДНК с использованием специфической для этих генов пары праймеров (прямого и обратного), комплементарных консервативным участкам на 5- и 3- концах гена (концевых) соответственно. Возможно также применение других пар праймеров (внутренних) для получения фрагментов гена различной длины. Однако при использовании этого способа следует помнить о возможных обстоятельствах, отрицательно влияющих на конечный результат, среди которых:
• — ингибирование ПЦР-амплификации примесями, экстрагируемыми из изучаемого образца вместе с препаратом ДНК;
• — избирательная амплификация (в случае недостаточной универсальности используемых праймеров);
• — образование по различным причинам ПЦР-ампилифицированных артефактов;
• — гетерогенность рибосомных генов в геноме одного организма.

В связи с применением данного способа остается неизвестным, насколько полно и правильно исходное разнообразие филотипов сообщества представлено в суммарной фракции ПЦР-амплифицированных рДНК.

• Проведение ПЦР после обратной транскрипции (RT-ПЦР).

Метод применяется в тех случаях, когда предполагается определить в сообществе не все, а только функционирующие гены I6S рРНК. Для этого из препарата суммарной рРНК с помощью обратной транскриптазы получают рДНК, а затем 16S рРНК аналогично предыдущему способу.