Синтез ДНК (репликация)

Полимеризация дочерней ДНК на матрице ДНК приводит к ее удвоению или репликации. Для реализации механизма репликации необходима матрица — расплетенная цепь ДНК, субстраты, участвующие в полимеризации ДНК, ферменты, катализирующие этот процесс, ионы Mg²*, а также белковые факторы, обеспечивающие деспирализацию двухнитевой ДНК. У прокариот ДНК имеет форму кольца, причем в определенном ori-сайте (origin — начало репликации) цепи расходятся и образуются две репликативных вилки, движущиеся в противоположных направлениях. У эукариот имеется большое число оп-сайтов, и репликация проходит одновременно на многих участках ДНК. В точках начала репликации отмечено большое количество А=Т пар оснований, соединенных всего лишь двумя водородными связями, что способствует более легкому разрыву и расхождению цепей.

Инициация репликации

Репликация всегда предшествует делению клетки и начинается с расплетения двойной спирали ДНК. Это осуществляется при помощи ферментов хеликаз, которые перемещаются вдоль цепей ДНК и раскручивают их. Процесс расплетения спиралей ДНК является энергозависимым и требует затраты АТФ. Интенсивное раскручивание ДНК может привести к образованию дополнительных витков. Это явление носит название положительной сверхспира— лизации или сверхскрученности и устраняется при помощи ферментов топоизомераз. В частности, топоизомераза II осуществляет релаксацию положительной свсрхспирализации за счет образования отрицательных сверхвитков. Топоизомераза II также носит название гираза. После расплетения двух нитей ДНК необходимо их стабилизировать в этом состоянии. Оказалось, что существует специальный белок, специфично связывающийся с одной из нитей ДНК и препятствующий обратной рекомбинации в двойную спираль. Его называют белком SSB (single strand binding). Таким образом, расплетение ДНК и образование репликативных вилок является достаточным основанием (при наличии ферментов и субстратов репликации) для удвоения ДНК.

Белки, вовлеченные в процессы репликации, представлены в табл. 28.1.

Непосредственно синтез новой цепи ДНК осуществляется при помощи ДНК-полимераз. У прокариот найдено три типа этих ферментов, а именно: ДНК-полимераза I, ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III. ДНК-полимераза I — протомер с молекулярной массой около 100 kDa. Фермент полифункционален; он обладает полимеразной и нуклеазной активностью. Принимает участие в процессах репарации ДНК. Роль ДНК-полимеразы II пока не совсем ясна, известно, однако, что мутации генов, ее кодирующих, не сказываются на жизнеспособности клеток. Из этих ферментов ДНК-полимераза III оказалась наиболее функционально значимой; именно этот фермент катализирует наращивание пол и нуклеотидной цепи ДНК. Он является олигомером и состоит из семи неравнозначных субъединиц, одна из которых обладает наибольшей полимеразной активностью. Оказалось, однако, что ДНК-полимераза III не может самостоятельно присоединяться к цепи ДНК и инициировать образование новой цепи, поэтому синтез должен быть инициирован какой-то другой структурой. Такой структурой является фрагмент РНК, который синтезируется в сайте инициации и к которому присоединяется ДНК-полимераза. Этот фрагмент называется праймером, а РНК-полимераза, катализирующая его образование, — праймазой.

У эукариот найдено пять типов ДНК-полимераз: а, е, р, у и 5. Основным ферментом синтеза ДНК у эукариот является ДНК-полимераза 8. Функции ДНК-полимеразы (3 подобны таковым для ДНК-полимеразы I прокариот. Что касается ДНК-полимеразы у, она катализирует процессы полимеризации нуклеотидов в митохондриях (табл. 28.2).

ДНК-полимеразы эукариот менее активны по сравнению с прокариотическими ферментами. ДНК-полимераза, а наращивает в секунду около 100 нуклеотидов, что почти в 10 раз меньше, чем ДНК-полимераза III у прокариот.

Таблица 28.2. Сравнительная характеристика ДНК-полимераз у прокариот и эукариот.