Связь биохимической структуры метаболизма микроорганизмов и кинетики роста микробной популяции

Все рассмотренные нами до сих пор модели являются модификациями модели Моно. Обоснованием их применения служит представление о том, что скорость роста микроорганизмов лимитируется одной из ферментативных реакций, скорость которой может быть записана по формуле Михаэлиса — Ментен, по форме совпадающей с формулой Моно. Таким образом, теория «узкого мест», или «бутылочного горлышка», позволила строить модели роста микроорганизмов уже в 50−60-е гг., когда было очень маю известно о биохимии и регуляции процессов роста и размножения. В последние десятилетия построены метаболические карты многих микроорганизмов, установлены регулирующие механизмы размножения, роста и отмирания клеток. В частности, установлено, что узкое место в цепи метаболirческих реакций и тип регуляции могут меняться в процессе культивирования. Соответственно должны меняться параметры и сама структура модели.

Еще одно ограничение рассмотренных выше моделей в том, что они не сегрегированные, т. е. не учитывают существования отдельных клеток. Такие модели не могут описывать, например, влияние геометрии клетки на ее рост. Только в сегрегированных моделях можно учесть такие свойства клет ки, как размер, форма, возраст. Эти параметры связаны с биохимическими процессами внутри клетки. Попытки создания моделей, учитывающих и структуру клеток и сегрегацию, приводят к сложным системам многих уравнений и могут быть реализованы только на мощных компьютерах. При этом важно правильно задать связь между структурной моделью отдельной клетки и моделью клеточной популяции, параметры которой соответствуют наблюдаемым в культуре.

Предложенные в последние годы модели включали различное число частей или компонент биомассы с более или менее подробным учетом внутриклеточных биохимических процессов. Теоретически можно допустить неограниченное число компонент, но это повлечет за собой трудности и вычислительного характера, и экспериментальной проверки моделей. Необходимо разумное ограничение числа компонент. Выделяют пять или более различных групп механизмов метаболизма клетки, учитываемых при структурном моделировании Roels, Kossen (1978). Это — образование материала клетки, катаболические пути, анаболический путь, баланс органических фосфатов и синтез ферментов.

Шулер с соавт. (Shuler et al., 1979) разработали структурную модель роста клетки E.coli, содержащую 14 переменных компонентов клетки. Моделировали скорость роста, время синтеза ДНК, форму и размер клетки, ее состав, реакцию этих величин на изменение внешней среды (например, концентрацию глюкозы-субстрата). Кинетические константы оцениваю из независимых экспериментов на экспоненциально растущих клетках. В дальнейшем модель была расширена, введены дополнительные параметры для более точного учета синтеза РНК и его регуляции, энергетических затрат клетки, моделирования систем, контролирующих транскрипцию и трансляцию.

Построение модели включало следующие этапы.

• 1. Представление клеточных компонент в виде переменных моделей.
• 2. Написание псевдохимических реакций для выведения стехиометрических соотношений в клетке.
• 3. Описание кинетических связей, отражающих общие зависимости основных метаболических путей.
• 4.

  Введение

  в структуру модели метаболических управляющих систем, использующих только концентрации химических компонент в качестве сигналов.

• 5. Оценка многочисленных кинетических и стехиометрических параметров из независимых экспериментов на клетках, растущих экспоненциально на комплексной или минимальной среде.

Для моделирования асинхронной культуры клеток E.coli Домах и Шулер (Domach, Shuler, 1984) рассмотрели популяцию как конечное число (225) взаимодействующих одиночных машинных клеток, распределенных по возрастам. Значения концентраций модельных компонент для машинной клетки данного возраста задавали из одноклеточной структурной модели. Эта же модель была использована для описания анаэробного роста популяции клеток E.coli в условиях хемостаза.

За прошедшие 20 лет были построены модели E.coli, которые содержат сотни уравнений и тысячи параметров (Chassagnol et al., 2002).

Такая схема исследования сохранилась и сейчас, однако успехи молекулярной биологии, генетики, биохимии позволили многократно детализировать предлагаемую схему возможностей вычислительной техники. Концепция подробного рассмотрения получила название «электронная клетка». Здесь мы опишем одну из первых подробных моделей, связывающих биохимические характеристики клетки с параметрами роста популяции.

При современном состоянии микробиологической науки необходимость учитывать биохимические сведения при построении кинетической модели очевидна. Однако здесь встает вопрос: сколько и какие именно компоненты клетки следует выбрать в качестве переменных модели? Впервые алгометризировать задачу удалось Л. Н. Дроздову-Тихомирову, II. Т. Рахимовой при построении модели культуры метанолусваивающих дрожжей. Работа по формулировке модели разбивается на два этапа. Построена схема энергетического и материального обмена и записаны стехиометрические уравнения синтеза промежуточных метаболитов на пути усвоения метанола у дрожжей, таких как аминокислоты, нуклеотиды компоненты клеточной стенки и мембран. Эти соединения в свободном и полимерном виде составляют практически всю сухую биомассу клетки.

Стехиометрическая модель представляется в виде канонической задачи линейного программирования. Вся совокупность биохимических реакций, возможных в дрожжевой клетке, записывается в виде матрицы, характеризующей их стехиометрию. Скорость реакции, описываемой г'-й строкой матрицы А, характеризуется числом актов этой реакции в единицу времени х,. Тогда в стационарном состоянии уравнение баланса образования — расхода г-го метаболита запишется в виде уравнения

Здесь a, ij — элемент матрицы Л, показывающий, какое число молекул j-ro метаболита расходуется или образуется в одном акте г-й реакции. Обратимая реакция описывается двумя строками, одна из которых получается умножением другой на —1. АГ — число типов ферментативных реакций, возможных в системе, из них к обратимы. А/ — полное число метаболитов в системе, fj — выходной поток j-ro метаболита, выраженный в количестве молекул на клетку данного метаболита за время генерации. Зная мономерный состав биомассы клетки, ее среднюю массу, можно рассчитать выходные потоки fj.

В стехиометрической модели для дрожжевой клетки, растущей на метаноле, учитывали 220 реакций (N), из них 185 (К) обратимы, с участием 217 (М) метаболитов.

Система (6.5.1) дополняется условиями:

Для нахождения максимального значения конверсии метанола в биомассу (экономического коэффициента) необходимо найти минимальное значение потока метанола в клетку min (xj), допустимое; системой уравнений (6.5.1) с ограничениями (6.5.2).

Проведенный расчег предельного значения экономического коэффициента для различного ферментного состава клетки — различного числа молекул НАДН на пути окисления метанола до ССЬ^) и различного числа точек сопряжения в дыхательной цепи — дал величину 0,56 г сухой биомассы/г потребленного метанола. При этом, если в окислении метанола участвует НАД-зависимая метанол гидрогенеза, т. е. число молекул Н АДН на пути окисления метанола до углекислого газа увеличивается от двух до трех, теоретический предел экономического коэффициента достигает 0,73 г биомассы/г метанола.

Результаты расчета и анализ распределения потоков указывают пути возможного повышения экономического коэффициента, в частности, введение фермента метанолгидрогеназы должно приводить к повышению его величины почти на 25%. Результаты подтверждаются экспериментально.

Второй этап работы представляет собственно построение кинетической модели. Располагая картиной распределения потоков превращения углерода в системе клетки, полученной с помощью стехиометрической модели, можно существенно сократить число переменных. При этом важно сохранить количественные связи, полученные на стехиометрической модели и построить редуцированную кинетическую модель, учитывающую основные биохимические процессы в клетке. Были сделаны следующие предположения.

• 1. Скорость суммарного синтеза белка определяется внутриклеточным пулом аминокислот, при этом фактически зависит от уровня лишь одной лимитирующей аминокислоты этого пула.
• 2. Кинетические закономерности ферментативных процессов внутри клетки описываются выражениями тина Михаэлиса-Ментен.
• 3. Транспорт субстрата (метанола) из среды в клетку и из клетки в среду может описываться выражениями типа Михаэлиса либо диффузией.
• 4. Скорость синтеза любого индивидуального белка в клетке пропорциональна произведению частоты инициации транскрипции соответствующего оперона на скорость суммарного синтеза белка.

Интегральная схема превращения метанола в биомассу, положенная в основу модели, представлена на рис. 6.13.

Введены следующие обозначения: у — концентрация метанола в среде; уч — концентрация кислорода; уз — концентрация метанола внутри клетки; у. — концентрация формальдегида внутри клетки; у$ — концентрация лимитирующей аминокислоты внутри клетки; ув — количество фермента Е (алкогольоксидазы) в клетке; у7 — количество фермента Еч (формальдегиддегидрогеназы) в клетке; yg — количество ассимилирующего фермента Eg в клетке; уэ — внутриклеточная концентрация АТФ; ую ~ число живых клеток в одном литре; уц — суммарное число клеток в одном литре; D — скорость протока; vo — объем клетки; у? — начальная концентрация метанола в среде: у? ~ начальная концентрация кислорода в среде.

Все сказанное выше относится к модели роста отдельной клетки. Для построения популяционной модели необходимо установить связь между удельной скоростью роста популяции и скоростью роста одной клетки. Ввиду важности этого соотношения приведем его вывод полностью (Рахимова, 1988).

Рис. 6.13. Интегральная схема превращения метанола в биомассу, положенная в основу кинетической модели (Рахимова, 1987).

Пусть n (t, т) — количество клеток в единице объема, имеющих в момент t массу в интервале [m, m + dm]. Общее число клеток в единице объема N (t) равно Введем P (t, m) — нормированное распределение клеток по массам: Тогда можно записать:

Предположим, убыль клеток происходит только за счет естественной гибели с удельной скоростью (3. Прибывание клеток происходит за счет отделения родительской клетки, только когда клетка достигает некоторой критической массы тп_кр, это обстоятельство войдет в граничное условие.

Пусть n (t-dt, m — dm) — число клеток в единице объема, имеющих массу в интервале m — dm, m в момент t — dt, тогда.

В то же время

Из (6.5.6) и (6.5.7), пренебрегая членами второго порядка малости, будем иметь:

или где lj = dm/dt — скорость роста клетки. Подставляя (6.5.5) в (6.5.9), получим:

или где // = удельная скорость роста популяции. После преобразований имеем:

Интегрируя последнее уравнение, получим:

Учитывая условие нормировки, распределение клеток, но массам имеет вид:

Для простоты соотношения между скоростью роста клетки и) и скоростью роста популяции // введем два предположения:

1) все клетки делятся точно пополам по достижении некоторой критической массы т_кр, время деления равно 0

2) распределение клеток по массам при делении клеток не меняется:

Отсюда.

После несложных преобразований получим:

а удельная скорость роста популяции без учета гибели клеток.

Общая модель роста хемостатной культуры метанолусваивающих дрожжей (см. схему рис. 6.11) представляет собой систему 11 дифференциальных уравнений:

Общий вид системы уравнений может быть применен для описания жизнедеятельности клеток микроорганизмов разных видов. Для метанолусваивающих дрожжей функции в правых частях детализированы.

fi — скорость транспорта метанола из среды в клетку: fi = = -, * —-—г. Предполагается, что транспорт метанола в клет;

(У 1 + л-ml)(У9 + «тпэ) ку — активный, /с — скорость транспорта метанола из клетки в среду:

/е = 7-, ,;^С Г. L. ' ^ЛЛЯ Ы¹У™^Я диффузии /_в = /'(у₃ — yi); /02 =.

= Fiy₆ + F2U7- Реакции превращений формальдегида и аминокислот также ферментативные:

Удельная скорость роста отдельной клетки.

Скорость роста популяции выражается формулой (6.5.14). 71 — доля потока ассимилирующего формальдегида, приходящаяся на синтез лимитирующей аминокислоты, 72 — доля потока лимитирующей аминокислоты в синтезируемом белке клетки.

Фермент первичного превращения метанола Е (алкогольоксидаза) индуцируется метанолом. Предполагается, что влияние индуктора метанола уз на скорость образования фермента Е можно представить в виде функции где А, А2, Си С2 — константы. Ферменты Е2 и Е3 считаются конститутивными, поэтому V2 и V3 — константы, du &2, — вероятности распада соответствующих ферментов.

Рис. 6.14. Кинетика изменений внутриклеточного уровня алкогольоксидазы уо (1), мгновенной удельной скорости роста у (2), внутриклеточной уз (3) и остаточной у (4) концентраций субстрата, суммарной биомассы (числа клеток уц) (5) в модели (6.5.15) во время переходного процесса при изменении скачком скорости протока от D = 0,05 ч^-1 к D = 0,1 ч^-1 при значениях констант: а — Сч = 20г^а/м²; V® = 0,01; К_гпз = 0,1 г/л; б — Сг = 20г²/м²; V = 0,05; К m3 = 0,1 г/л (Рахимова, 1985).

На рис. 6.14 представлены результаты исследования динамического поведения модели — переходные процессы, наблюдаемые в эксперименте при скачкообразном изменении скорости протока. 13 этом случае в проточной культуре возникают затухающие колебания. Расчет показал, что существование таких колебаний связано с взаимодействием внутриклеточных процессов с проточной средой хемостата и может быть снято регулированием скорости протока.

Мы намеренно столь подробно остановились на модели метанолусваивающих дрожжей, чтобы показать, как биохимические знания и кинетические модели в совокупности могут служит ь практическим целям микробиологической промышленности. Давать путь увеличения эффективности производства — повышения экономического коэффициента, рекомендовать способы оптимизации переходных процессов — ликвидации нежелательных колебаний. Структурное моделирование микроорганизмов имеет' самые широкие теоретические и практические перспективы.