История и методики изучения анатомии нервной системы

В результате изучения данной главы студент должен:

знать

• • историю изучения нервной ткани и НС;
• • современные методы (морфологические, цитологические, молекулярные, электрофизиологические и др.) изучения строения и функций НС;

уметь

• • решать задачи, связанные с выбором методики изучения ПС в зависимости от поставленной цели;
• • определять связи между применяемой методикой исследования и поставленной задачей;
• • грамотно ориентироваться в современных методах изучения строения и функций НС;
• • применять теоретические знания к оценке результатов исследований НС;

владеть

• • навыками поиска информации, необходимой для адекватной интерпретации результатов исследований НС;
• • навыками работы с учебной и научной литературой об исследованиях структуры и функций ПС.

Методы изучения анатомии нервной системы

Многие методы изучения морфологии НС являются общеанатомическими, которые условно можно разделить на макрои микроскопические. Первые исследуют строение всего организма, его систем, отдельных органов и их частей. Микроскопические методы изучают строение клеток и тканей организма, являясь в то же время методами цитологии и гистологии. Существуют и специфические методы для изучения строения именно НС, связанные с особенностями ее строения и функционирования.

Методики изучения НС очень многочисленны, в этой главе мы опишем основные из них, а также наиболее часто употребляемые в настоящее время.

С древних времен и вплоть до изобретения микроскопа основным методом в анатомии был метод рассечения, препарирования, что и дало название этой науке (от греч. avaxopr| — рассечение). Это метод посмертного изучения мозга, который после извлечения из полости черепа (ГМ) или из позвоночного канала (СМ) сначала фиксируется в растворах формалина или различных спиртов, что необходимо для его уплотнения и длительного хранения. После этого можно разделять мозг на части, изучая их строение, а также осуществлять собственно рассечение — разрезать в различных плоскостях, прослеживая переходы одной структуры в другую.

Принципиально новый подход к изучению анатомии дало изобретение микроскопа в XVII в. Основной характеристикой любой оптической системы является ее разрешающая способность, или просто разрешение, — наименьшее расстояние между двумя точками, при котором их можно воспринимать как разные. Для нормального глаза, как биологической оптической системы минимальное разрешение при наиболее оптимальных условиях в среднем равно 0,176 мм. Размеры большинства клеток и микроорганизмов гораздо меньше. Для изучения таких биологических (а также химических и физических) объектов и нужен микроскоп.

Изобретение микроскопа связывают с именами голландца 3. Янсена и итальянца Г. Галилея. Лучшие микроскопы в XVII в. (микроскопы Левенгука) увеличивали наблюдаемые объекты в 300 раз. Современные световые микроскопы имеют разрешающую способность 130—350 нм (0,13—0,35 мкм), т. е. могут увеличивать объект в 2500—3000 раз. Благодаря этому при помощи светового микроскопа можно видеть не только сами клетки, но и клеточные органоиды. Первым увидел, описал и дал увиденному название «клетка» (cell) английский физик Р. Гук в 1665 г.

В XX в. был изобретен электронный микроскоп, который может дать увеличение в 10⁶ раз. В современных электронных микроскопах разрешение составляет 0,1—0,7 нм (в теории до 0,002 нм). Такой микроскоп позволяет изучать клетки на макромолекулярном уровне (например, увидеть молекулу ДНК), а также получать сведения об объемной организации клетки. Недостатком электронной микроскопии с точки зрения биологии является невозможность изучения живых объектов.

Последним достижением в области микроскопии было изобретение папоскопа — флюоресцентного микроскопа, позволяющего видеть объекты с разрешением 10—30 нм, т. е. на наноуровне. В отличие от электронного микроскопа, с помощью наноскопа можно наблюдать живые объекты, при этом не только увидеть фрагменты органоидов, но и наблюдать, например, взаимодействие белков друг с другом. «За создание флюоресцентной микроскопии высокого разрешения» изобретателям наноскопа немецкому ученому Ш. Хеллю и американским ученым Э. Бетцигу и У. Мёрнеру в 2014 г. была присуждена Нобелевская премия по химии.

Микроскопические исследования проводятся или на живых клетках (витальное изучение), или на клетках, которые предварительно подвергаются различным способам фиксации, их убивающим. Еще А. Левенгук наблюдал в капле воды под микроскопом движущиеся микроорганизмы. Но для многоклеточных организмов такой способ изучения невозможен. Для наблюдения клеток и тканей многоклеточного организма чаще всего используют метод клеточных культур. Для этого одну или несколько живых клеток помещают в питательную среду, где они могут продолжать жизнедеятельность, сохраняя при этом способность к делению. Обычно в результате размножения образуется однослойный пласт клеток, очень удобный для прижизненного исследования. Самые хорошие результаты получаются при использовании в качестве исходного материала стволовых клеток, обладающих максимальной способностью к делению.

Метод клеточных культур дает возможность изучать деление и рост клеток, их дифференцировку, взаимодействие с другими клетками, влияние на них биологически активных веществ и т. д. Для культивирования разных видов клеток разработаны специальные среды, необходимые для их жизнедеятельности и размножения, например, для развития нейронов необходимы нейротрофины (факторы роста нервов).

Но методы культивирования клеток были разработаны только в XX в., так что первые нейроны увидели с помощью методов фиксации. Главная задача при фиксации клеток — это как можно лучше сохранить прижизненную структуру клетки и не допустить появления в ней артефактных, т. е. отсутствующих в живой клетке, структур. Пока еще эта задача окончательно не решена. Чаще всего для фиксации используются формальдегид или формалин и спирты. При исследованиях с помощью электронного микроскопа хорошие результаты дает криофиксация (замораживание) объекта.

Для приготовления препарата для микроскопии после фиксации органа или его части необходимо приготовить тонкие срезы толщиной для светового микроскопа 5—10 мкм, а для электронного — не больше 0,1 мкм. Это делается с помощью специального прибора — микротома или ультрамикротома для электронной микроскопии. После этого срезы подвергают дополнительной обработке, например окрашиванию в световой микроскопии или напылению солями металлов — в электронной. Это усиливает контрастность изучаемого объекта и позволяет выявить в нем ряд деталей. Методы окрашивания очень многочисленны и разнообразны, их выбирают в зависимости от задач исследования. Чтобы обеспечить длительное хранение препарата, его заливают канадским бальзамом и сверху накрывают покровным стеклом.

Наибольшее значение для изучения нервной ткани имели методы окраски по методикам К. Гольджи, С. Рамон-и-Кахаля и Ф. Ниссля (см. параграф 17.3).

Для понимания работы НС совершенно необходимо не только знать строение отдельных мозговых структур, но и понимать, как эти структуры связаны друг с другом, т. е. хорошо знать ход нервных волокон.

До XX в. основным методом для прослеживания хода нервных путей был ме?под сравнения последовательных срезов одного направления, впервые примененный немецким анатомом и хирургом Б. Штиллингом (1810—1879). При сравнении таких срезов в некоторых случаях можно проследить направление, в котором идет пучок нервных волокон, и понять, какие структуры он соединяет. Этот метод применим далеко не во всех случаях. Волокна разных трактов могут проходить часть пути вместе, от них могут отходить коллатерали, да и сами пути могут быть очень небольшими и с трудом отличимыми от окружающей ткани.

В дальнейшем появилось множество других методов для определения хода нервных волокон. Отметим некоторые из них.

Метод вторичных перерождений основан на открытом в середине XIX в. британским нейрофизиологом А. Валлером явлении, названным валлеровской дегенерацией: если волокно отделено от клетки, оно перерождается (дегенерирует). Этот метод был усовершенствован американским ученым У. Наута (1916—1994), который использовал тот факт, что при дегенерации волокна оно окрашивается не так, как соседние неповрежденные волокна. Поэтому можно разрушить какую-либо структуру и через несколько дней, окрасив мозг, проследить, куда она посылает свои аксоны.

Ряд методов изучения мозговых связей основан на использовании аксонного транспорта, как антероградного, так и ретроградного (см. параграф 2.3). Например, фермент пероксидаза хрена может захватываться из окружающей среды нервными окончаниями и ретроградным аксонным транспортом доставляться в тело нейрона. Присутствие этого фермента в клетке определяется специальными биохимическими методами, что дает возможность проследить ход нервного волокна. Или, используя радиоавтографические методы, можно ввести в какую-либо мозговую структуру вещество с радиоактивной меткой, которое поглощается сомой нейронов, транспортируется по аксонам и накапливается в их окончаниях.

Современная анатомия тесно взаимодействует с физиологией, знание функций отделов головного мозга позволяет лучше понять их строение, поэтому в анатомии достаточно широко использовались и физиологические методики — перерезки нервов и проводящих путей, разрушение отдельных структур, раздражение участков мозга. Наблюдая нарушения каких-либо функций организма после перерезок и разрушений, можно было судить о значении отделов мозга в организации этих функций.

Метод раздражения применялся еще в XIX в. При его помощи выдающийся русский физиолог И. М. Сеченов (1829—1905) открыл явление центрального (сеченовского) торможения. В XX в. канадский нейрохирург У. Г. Пенфилд (1891 — 1976) применил этот метод во время нейрохирургических операций на открытом мозге. Он проводил электрическую стимуляцию различных отделов мозга, больные (которые в это время находились в сознании) отчитывались в своих ощущениях. Проанализировав полученные данные, Пенфилд создал функциональные карты поверхности коры больших полушарий (пенфилдовский гомункулус, см. параграф 9.3).

Практически все изложенные выше методы — это методы посмертные или инвазивные, т. е. требующие нарушения целостности организма. Естественно, на живом человеке применять эти методы невозможно. Исключением являются только исследования, проводимые при операциях на мозге, по они бывают обусловлены медицинскими показаниями.

Во второй половине XX в. начали интенсивно развиваться физиологические неинвазивные методы исследования мозга, такие как электроэнцефалография (ЭЭГ), магнитоэнцефалография (МЭГ), реоэнцефалография (РЭГ), допплерография и др. С помощью ЭЭГ исследуется суммарная электрическая активность поверхности мозга в норме, при функциональных нагрузках и при патологии. МЭГ регистрирует магнитную составляющую электромагнитного ноля ГМ. МЭГ имеет некоторые преимущества по сравнению с ЭЭГ. Этот метод регистрации не только неинвазивный, но и бесконтактный, т. е. испытуемый чувствует себя более комфортно. И главное, МЭГ отражает не только поверхностную, но и глубинную активность мозга. РЭГ и допплерография (ультразвуковое исследование) показывают состояние кровеносных сосудов мозга и широко используются при медицинской диагностике. Но все эти методы не дают возможности получить данные о чисто анатомическом строении мозговых структур. Эта проблема начала решаться с появлением методов нейровизуализации (нейроимиджинга).

Нейро визуализация — общее название нескольких методов, позволяющих в наглядной форме визуализировать прижизненные структуру, функции и биохимические характеристики мозга. Все эти методы можно разделить на две группы — структурные, позволяющие изучать строение мозга, и функциональные, отображающие мозговую активность (кровоток, медиаторно-рецепторные характеристики и т. п.).

К структурным методам можно отнести компьютерную томографию (КТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ), МРТ-ангиографию.

Основные функциональные методы — это позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ).

С развитием компьютерной техники такие методы исследования, как ЭЭГ и МЭГ, также позволяют визуализировать мозговую активность. Создан ряд компьютерных программ, таких как Брэйн-Лок, CONAN, LORETA, дающих возможность на основании электрической и магнитной активности мозга отслеживать тонкие изменения функционального состояния человека. Эти программы используются в неврологии и психиатрии для постановки диагноза, а также в психофизиологических исследованиях. В настоящее время ЭЭГ-картирование мозга является наиболее доступным и широко распространенным методом функциональной нейровизуализации.

Общим для всех томографических методов является изображение мозговых структур, представленных в виде срезов в разных плоскостях. В истории изучения анатомии есть аналоги томографических методов. Великий русский хирург Н. И. Пирогов (1810—1881) для изучения взаиморасположения органов разработал метод «топографической анатомии», при котором изучались послойно разрезанные в различных плоскостях замороженные трупы. По результатам исследования Пироговым был издан атлас, изображения в котором сходны с сегодняшними томограммами.

Современные томографические методы впервые позволили заглянуть в глубины организма, в том числе и мозга, живого человека. Первым таким методом стала компьютерная томография (рентгеновская КТ). При обычном рентгеновском обследовании можно увидеть только кости черепа. Методом КТ получают изображения томограмм — срезов мозга толщиной 3—10 мм в продольном и поперечных сечениях. В основе метода лежит компьютерная реконструкция изображения, которое получают при круговом просвечивании объекта узким пучком рентгеновского излучения. Программа вычисляет степень поглощения этих лучей структурами НС, хорошо отличает мягкие ткани от окружающих их тканей и строит томограммы — изображения срезов мозга толщиной 3—10 мм. Иногда для увеличения контрастности изображения в организм вводят йод-содержащие препараты. КТ предоставляет детальную информацию не только о строении здорового мозга, но и о нарушениях его структуры. Например, у многих больных шизофренией было выявлено расширение латеральных и III мозговых желудочков, увеличение объема или, наоборот, частичная атрофия каллозальных волокон (волокон мозолистого тела), морфологическая асимметрия ГМ.

В 1979 г. за разработку метода компьютерной томографии английский инженер-физик Г. Н. Хаунсфилд и американский физик А. М. Кормак были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Ведущим неинвазивным методом нейровизуализации в настоящее время является магнитно-резонансная (МРТ) или ядерно-магнитнорезонансная (ЯМР) томография. Этот метод, появившийся в 1970;х гг., основан на физическом явлении протонного магнитного резонанса. Суть его состоит в следующем. Протоны — ядра атомов водорода (и некоторые другие ядра) — имеют собственное магнитное поле. Когда образец помещают в мощное постоянное магнитное поле, микромагнитные поля протонов выравниваются параллельно силовым линиям внешнего поля. Если в это время воздействовать на объект радиоволнами определенной (резонансной) частоты, то параллельно ориентированные протоны будут поглощать энергию радиоволн и переходить в высокоэнергетическое состояние. После выключения радиочастотных импульсов в течение некоторого времени (время релаксации) протоны возвращаются в исходное состояние, выделяя при этом энергию. Энергия радиоволн, необходимая для получения резонанса, зависит от величины внешнего магнитного поля и от химического окружения ядра. Так как такое явление возможно и для ядер некоторых других атомов, его называют ядерно-магнитным резонансом.

В теле человека очень много воды, каждая молекула которой (Н₂0) включает два протона. Если обработать резонансные сигналы от этих протонов, можно выяснить, каково содержание воды в тканях организма. При MPT-исследовании внешнее магнитное поле организовано таким образом, что в каждой точке пространства, в котором находится человек, напряженность магнитного поля несколько отлична от соседней точки. Это дает возможность регистрировать ЯМР от небольших участков тела и с помощью компьютера создавать послойное или объемное (3D) изображение организма. С помощью метода МРТ можно сканировать любую часть тела в любом направлении. Пространственное разрешение метода МРТ составляет 1—2 мм, его можно повысить внутривенным введением контрастирующих препаратов.

Качество изображения при МРТ выше, чем при КТ. МРТ-изображения гораздо контрастнее, на них очень четко различаются серое и белое вещество мозга, лучше визуализируются глубинные структуры мозга, отсутствуют характерные для КТ артефакты. Также немаловажно, что этот метод не связан с воздействием на организм рентгеновского излучения.

Но и метод КТ имеет свои преимущества. МРТ, в отличие от КТ, не может выявить некоторые патологические изменения мозговой ткани, например присутствие кальцификатов. Кроме того, МРТ неприменима к пациентам с металлическими телами в черепе и с кардиостимулятором.

Проведение и КТ, и МРТ связано с тем, что человек некоторое время находится в узком замкнутом пространстве, поэтому людям, страдающим клаустрофобией, некоторым психиатрическим больным, а также маленьким детям эти процедуры противопоказаны. Но время пребывания в камере при КТ гораздо меньше, чем при МРТ, поэтому при необходимости томографического обследования таких больных преимущественно выбирают КТ.

Тем не менее метод МРТ почти не имеет недостатков (если не считать его дороговизну). Изобретатели это метода британский ученый П. Мэнсфилд и американский ученый П. К. Лотербур в 2003 г. были также удостоены Нобелевской премии.

На базе метода МРТ было создано несколько его модификаций, например МРТ-ангиография, позволяющая получать изображение кровеносных сосудов благодаря тому, что магнито-резонансный сигнал от подвижной ткани (кровь) отличается от МР-сигналов, лежащих вокруг неподвижных тканей. Диффузионная тензорная визуализация (ДТВ) дает возможность увидеть пучки нервных волокон, которые соединяют различные зоны ГМ, а также выявить локализацию поражения проводящих путей.

Для научных исследований особенно важно появление функциональных методов исследования. Функциональная МРТ (фМРТ) позволяет определить функциональные особенности различных участков мозга, благодаря тому что в активно работающих областях кровоток усиливается. С помощью МРТ можно проследить, какие области активируются при выполнении испытуемым различных заданий. МР-спектроскопия дает возможность визуализировать не только анатомическую структуру мозга, но и распределение в нем ряда биологически активных веществ, например нейромедиаторов.

Еще один новейший функциональный томографический метод — это позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), позволяющая изучать деятельность мозга на нейро-медиаторно-рецепторном уровне. Перед исследованием в организм человека вводится радиофармпрепарат, т. е. препарат, меченый изотопом, излучающим позитроны (например, изотопы фтордезоксиглюкозы, меченые агонисты рецепторов, предшественники медиаторов). Позитроны не повреждают живую ткань, но улавливаются томографом. В зависимости от используемого препарата можно исследовать такие процессы, как транспорт веществ, взаимодействие между медиатором и рецептором, метаболические изменения и т. д. Таким образом, ПЭТ, в отличие от компьютерной и магнитно-резонансной томографии, оценивает функциональные изменения па клеточном уровне. Такие изменения часто предшествуют морфологическим изменениям, поэтому ПЭТ может диагностировать развитие заболевания гораздо раньше, чем КТ и МРТ.

Отметим еще несколько методов исследования строения мозга, появившихся уже в XXI в.

Брэйнбоу (англ, brainbow) — еще один метод нейровизуализации, при котором нейроны окрашиваются флуоресцентными белками. Сначала для окраски клеток использовали зеленый флуоресцентный белок {green fluorescent protein, GFP), выделенный из светящейся медузы эквореи {Aequorea victoria), который флуоресцирует в зеленом диапазоне при освещении его синим светом. В настоящее время ген этого белка широко используется в качестве светящейся метки в клеточной и молекулярной биологии. Выведены специальные «светящиеся» животные (например, свиньи), у которых GFP внесен в геном и передается по наследству. В дальнейшем были получены несколько мутаций, направленных на изменение цвета свечения белка. Были получены варианты с красным, оранжевым, голубым, синим и желтым свечением.

Метод Brainbow был первоначально разработан в 2007 г. группой американских ученых в отделе нейробиологии медицинской школы Гарварда. Они разработали генетический метод маркировки каждого отдельного нейрона в свой цвет (сейчас уже возможно окрашивать нейроны в 90 различных цветов). На фотографиях, сделанных с помощью этого метода, можно увидеть не только взаимное расположение нейронов, но и проследить ход отдельных нервных волокон. Свое название метод получил от сочетания английских слов brain (мозг) и rainbow (радуга); действительно, изображения окрашенных в разные цвета нейронов напоминают радугу.

Особенно большое внимание нейробиологов привлекает кора больших полушарий, так как большинство высших познавательных функций связывают именно с корой. Немаловажно и то, что нередко неврологические заболевания изменяют ее структуру.

Более детальное изучение корковой поверхности стало возможно благодаря ряду компьютерных программ, позволяющих визулизировать экспериментальные данные МРТ, ЭЭГ и МЭГ с наложением непосредственно на виртуальную интерактивную поверхность мозга. В числе таких широко используемых программ и плагинов следует особо выделить FreeSurfer, отличающийся наглядностью и простотой использования. В программах такого рода можно получить «раздутый (разглаженный) мозг» {inflated brain surface). Программные инструменты проецируют корковую поверхность на топологически эквивалентную ей сферическую поверхность, причем степень «раздутости» можно варьировать по желанию во всем диапазоне от анатомически корректного трехмерного представления до гладкой сферической поверхности. Также нередко применяется развертка поверхности мозга на плоскость (с отдельными немногочисленными разрывами). В результате таких преобразований корковые поверхности, скрытые в глубине борозд, оказываются на поверхности и хорошо видимы. Для наглядности области коры внутри борозд обычно показываются более темным цветом, чем поверхность извилин. Все это дает возможность более точно рассчитать площадь коры больших полушарий, увидеть взаимное расположение областей в трехмерном пространстве, а также более наглядно картировать функциональные зоны коры, что существенно облегчает работу с различными экспериментальными данными, как структурными (например, исследование толщины коры), так и функциональными (например, активация областей коры).