Практикум. 
Микробиология: теория и практика

Вопросы и задания для самоконтроля.

• 1. Почему поток энергии в экосистеме не является замкнутым?
• 2. Какие группы микроорганизмов функционируют на разных уровнях любой экосистемы?
• 3. Как микроорганизмы делают многие соединения доступными растениям и животным?
• 4. В чем особенности микробных местообитаний?
• 5. Как можно определить наличие в пробе нскультивирусмых микроорганизмов?
• 6. В чем особенность отбора проб природных образцов?
• 7. Перечислите методы определения активности микроорганизмов в природных условиях.
• 8. 11азовите возможные пути «увода» из циклов и возвращения элементов в них.
• 9. Какие реакции цикла азота могут осуществлять только прокариоты?
• 10. Назовите группы микроорганизмов, использующие сероводород в присутствии и отсутствии кислорода.
• 11. Почему фосфор является элементом, ограничивающим рост живых организмов в природных местообитаниях?
• 12. Как используется микроорганизмами железо в анаэробных и аэробных условиях?
• 13. Почему загрязнение ксенобиотиками приобрело характер глобальной проблемы?

Семинар 1.

Микроорганизмы вокруг нас (в повседневной жизни человека) Семинар рекомендуется проводить в форме докладов и презентаций студентов и последующего их обсуждения. При подготовке материала студенты должны руководствоваться соответствующим разделом учебника как планом, который дополнен конкретными примерами из монографий и оригинальных статей научных микробиологических журналов, найденных по ключевым словам, а также из рекомендованной литературы.

Семинар 2.

Участие микроорганизмов в процессах очищения окружающей среды Семинар рекомендуется проводить в форме докладов и презентаций студентов и последующего их обсуждения. При подготовке материала студенты должны руководствоваться соответствующим разделом учебника как планом, который дополнен конкретными примерами из монографий и оригинальных статей научных микробиологических журналов, найденных по ключевым словам, а также из рекомендованной литературы.

Лабораторная работа 1.

Биоразрушение различных веществ микроорганизмами.

Цель работы: показать роль микроорганизмов в процессах разрушения органического и неорганического материалов в природе. При выполнении работы студенты имеют возможность проверить, будут ли способны разрушаться естественным путем их собственные домашние отходы, проанализировать отличия биоразрушаемых и бионеразрушаемых материалов и проследить, как элементы, содержащиеся в отходах, могут быть снова включены в круговороты.

При физическом разрушении материал просто измельчается без изменения его химической природы (например, при эрозии почвы и скал). Химическое разрушение, к которому относится и биоразрушение, приводит к изменению молекул материала в результате химических реакций. Отходы, подвергшиеся химическому разрушению, часто отличаются резким запахом, так как микроорганизмы при биоразрушении образуют газы и летучие вещества.

Когда организм погибает, его полимерные молекулы подвергаются разрушению с образованием простых веществ, которые могут быть вновь использованы другими организмами. Поэтому так важна роль микроорганизмов-деструкторов, значительная часть которых относится к гидролитикам. Если бы деструкторы не перерабатывали отмершее органическое вещество, то на планете накопилась бы мертвая масса и первичные продуценты были бы лишены неорганических веществ (прежде всего углекислого газа) для проведения фотои хемосинтезов.

Необходимые материалы (на 1 студента): микроскоп, предметные и покровные стекла, БСА (800—1000 мл), водопроводная вода, биоразрушаемый и бионеразрушаемый материал, ножницы или нож, прозрачные сосуды на 500—800 мл — 3 шт., ватные пробки для сосудов — 3 шт., резиновые пробки для сосудов — 3 шт., прозрачные стаканчики на 200—300 мл — 3 шт., маркер, градуированный цилиндр на 10—25 мл, линейка, пипетки на 1—2 мл — 3 шт., чашки Петри — 1—2 шт., микробиологическая петля, пинцет, газовая горелка или спиртовка.

Для выполнения работы готовят к стерилизации и стерилизуют пипетки и пустые чашки Петри, а также БСА в колбах. Затем расплавленный и остуженный до 45 °C БСА разливают стерильно у пламени горелки (спиртовки) в стерильные чашки Петри по 20—25 мл. Студенты должны принести из дома биоразрушаемые и бионеразрушаемые материалы (остатки пищи, фруктов, кусочки пластика, стекла, бумаги и т. д.). Мусор делят на две части (биоразрушаемый и биоустойчивый) и заносят их компоненты в табл. 14.1.

Таблица 14.1

Состав материала, взятого для опыта.

Затем каждый компонент измельчают на кусочки примерно по 1 см³ или 2 см² и формируют две кучки, смешав отдельно биоразрушаемые и биоустойчивые компоненты. Сосуды для эксперимента подписывают, обозначив № 1 биоразрушаемые материалы, № 2 — бионеразрушаемые и № 3 — их смесь. В сосуд № 1 добавляют небольшое количество биоразрушаемой смеси. Затем половинное количество того же материала вносят в сосуд № 3. Сосуды заполняют так до тех пор, пока № 1 не наполнится почти доверху, а № 3 — наполовину. Не следует утрамбовывать материалы, они должны лежать свободно. Таким же образом заполняют сосуд № 2 биоустойчивой смесыо, добавляя ее половинное количество и в сосуд № 3. Все три сосуда должны быть заполнены почти доверху. Сосуды закрывают резиновыми пробками и тщательно перемешивают содержимое, энергично встряхивая его.

В сосуд № 1 добавляют воду с помощью цилиндра порциями по 10 мл, записывая число порций. После добавления каждой новой порции воды встряхивают содержимое, закрыв сосуд резиновой пробкой. Все содержимое в сосуде должно быть равномерно смочено. Воду добавляют до тех пор, пока на дне не образуется устойчивый слой в 1 — 1,5 см. Записывают общий объем добавленной воды. Такое же количество воды вносят в сосуды № 2 и 3 при тщательном перемешивании. Содержимое каждого сосуда описывают в табл. 14.2.

Таблица 14.2

Характеристика содержимого в опытных сосудах.

Сосуды закрывают ватными пробками и помещают для инкубации в термостат при 25—30°С. Еженедельно следят за изменением содержимого сосудов в течение 3 недель, заполняя табл. 14.2. В табл. 14.1 ставят в скобках цифру 1 рядом с компонентом, который будет разрушен в самое короткое время. Цифрой 2 обозначают компонент, разрушенный в последнюю очередь. Цифрой 3 помечают материал, который не разрушился за время инкубации.

Через 3 недели готовят три предметных стекла, пометив их номерами 1, 2 и 3. Пипеткой набирают жидкость со дна сосуда № 1 и наносят каплю на предметное стекло № 1. Препарат накрывают покровным стеклом. Используя новые пипетки, готовят препараты из сосудов № 2 и 3. Препараты «раздавленная капля» просматривают под микроскопом с объективом 40Х, зарисовывают в каждом случае микроскопическую картину и описывают свои наблюдения в лабораторных журналах. Отмечают наличие простейших, гиф и спор грибов и бактерий разной морфологии, а также характер их подвижности. Используя пинцет, переносят материал из образовавшихся в сосуде № 1 грибных и бактериальных колоний на предметное стекло, добавляют каплю воды и накрывают покровным стеклом. Рассматривают препарат под объективами 10Х и 40Х, зарисовывают и описывают микроскопическую картину в лабораторном журнале. Последовательно готовят препараты из сосудов № 2 и 3, если там будут колонии, рассматривают и зарисовывают микроскопическую картину.

Дно каждой чашки Петри с БСА деляг с помощью маркера на три сектора (рис. 14.7), подписывая их 1, 2 и 3. Прокаленную и остуженную микробиологическую петлю опускают в жидкость из сосуда № 1 и проводят зеркальцем по агару в секторе 1 зигзагообразным движением от края к центру чашки, стараясь не попадать за границы.

Повторяют ту же процедуру для сосудов № 2 и 3, засеяв секторы 2 и 3 в чашке. Чашки помещают на инкубацию при комнатной температуре на 48 ч. По окончании инкубации рассматривают и зарисовывают микробный рост на поверхности агара в чашке. Отмечают наличие бактерий и плесневых грибов и степень их биоразнообразия.

Делают выводы о возможных причинах различий процессов биоразрушения в разных сосудах и о биодеградабельности взятых для опыта компонентов.

Рис. 14.7. Схема посева проб жидкости из сосудов.

Лабораторная работа 2.

Анаэробная биодеградация азокрасителя Acid Orange 7 микроорганизмами активного ила.

Цель рабоупы: изучение процесса биодеградации азокрасителя сообществом активного ила в анаэробных условиях и влияния на него ряда факторов (токсичности ксенобиотика, внесения дополнительного источника углерода, ингибирования ацетокластического метаногенеза).

Сброс огромного количества бытовых и промышленных отходов создает избыточную нагрузку на природные экосистемы, в основном из-за созданных человеком соединений, которые в обычных условиях не разрушаются. Самоочищение природных экосистем связано прежде всего с огромным потенциалом микробной активности. Производственные процессы очистки и переработки отходов деятельности человека также основаны на микробной биодеградации.

Химическая и нефтехимическая промышленность является основным источником токсичных и устойчивых к биоразложению загрязнений. Одной из наиболее распространенных и широко используемых групп таких загрязнений являются красители — синтетические органические вещества, проявляющие большое разнообразие структур и используемые для различных целей в текстильной, косметической, бумажной, пищевой и фармакологической промышленности. Самую большую группу синтетических красителей составляют азокрасители. Благодаря своему химическому строению азокрасители поглощают свет в видимой области спектра. Химическая структура азокрасителей характеризуется наличием одной или более азогрупп (—N = N—). Азогруппа соединена с бензольным или нафталиновыми кольцами, которые могут содержать большое количество различных заместителей, таких как хлор (—Cl), метил (—СН₃), нитрогруппу (—N0₂), аминогруппу (—NH₂), гидроксил (—ОН) и карбоксильную группу (—СООН). В азокрасителях в качестве заместителя часто встречается сульфогруппа (—S0₃H).

Азокрасители, содержащие такой заместитель, называются сульфоазокрасителями. В процессе производства и использования азокрасителей примерно 10—50% попадает в окружающую среду и может накапливаться в биосфере. Даже небольшой концентрации красителя достаточно, чтобы сточные воды были сильно окрашены. Помимо негативного эстетического эффекта некоторые красители и многие продукты их неполной трансформации, особенно в аэробных условиях, оказывают сильное токсичное и (или) канцерогенное влияние на живые организмы. Деградация красителей химическими и физико-химическими методами является дорогостоящей и имеет массу других недостатков. Аэробные микробиологические методы обработки сточных вод, загрязненных азокрасителями, крайне неэффективны.

В то же время азокрасители могут подвергаться анаэробному восстановлению с помощью неспецифических азоредуктаз различных групп микроорганизмов. Среди бактерий, проводящих такой процесс, — молочнокислые бактерии, Proteus sp., Enterococcus sp., Aeromonas hydrophilia, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis, B. pyocyaneus, B. cereus, Pseudomonas sp., Caprococcus catus, Fusobacterium sp., Bacteroides thetaitaomicron, Peptostreptococcus productus, Eubacterium biforme, Bifidobacterium inf antis, Citrobacter sp. и т. д. При расщеплении азосвязи нарушается структура хромофорной части красителя, что приводит к его обесцвечиванию и образованию соответствующих ароматических аминов (рис. 14.8), которые часто более токсичны, чем исходные соединения.

Рис. 14.8. Механизм восстановления азосвязи в анаэробных условиях.

При отсутствии такого сильного окислителя, как кислород, разрушение ароматических веществ происходит более сложно, в несколько этапов. Основными этапами процесса биодеградации являются активирование бензольного кольца, его разрыв и образование C_t— и С₂-соединений. Существуют три различных пути конверсии ароматических соединений в анаэробных условиях, отличающиеся центральными интермедиатами. Этими интермедиатами являются бензоат, резорцин и флороглюцин.

В настоящее время наиболее распространенным среди микроорганизмов считается бензоил-КоА-путь биодеградации ароматических веществ (через образование КоА-тиоэфира бензоата). Микроорганизмы способны использовать широкий набор ароматических субстратов в нитрат-, сульфат-, железои карбонат-восстанавливающих условиях. На сегодняшний день из микроорганизмов, способных к биодеструкции ароматических соединений, в виде чистых культур выделены Pseudomonas sp., Thauera aromatica, T. chlorobenzoica, Desulfobacterium anilini, Azoarcus evansii, Magnetospirillum sp., Delftia acidovorans, Rhodopseudomonas palustris, Syntrophus gentinae и S. buswellii. Значительно более успешно биодеградацию таких соединений осуществляют анаэробные микробные сообщества. Использование в качестве акцептора электронов Н⁺ требует присутствия в системе синтрофных партнеров, потребляющих молекулярный водород (метаногенов, сульфидогенов или гомоацетогенов). В метаногенных условиях конечные стадии биодеструкции представлены археями родов Methanosarcina, Methanospirillum, Methanosaeta и Methanobacterium.

Конверсия любого сложного органического вещества с получением метана требует наличия, как минимум, бактерий, расщепляющих исходное соединение с образованием сбраживаемых веществ, микроорганизмов, осуществляющих брожение с образованием в конечном счете ацетата, углекислоты и водорода, и метаногенов.

При деградации грудноразлагаемых соединений возрастает значение кометаболизма. Как правило, этот процесс характеризуется тем, что культура, трансформирующая чужеродное соединение, при этом не размножается и скорость процесса остается постоянно низкой, а продукты трансформации могут накапливаться в окружающей среде. Применительно к микробному сообществу именно такая стадия может быть лимитирующей для общего процесса полной минерализации ксенобиотика, и тогда внесение дополнительного источника углерода и энергии может существенно повлиять на скорость биодеградации и время формирования стабильной высокоактивной ассоциации микроорганизмов.

Метаногенное сообщество активного ила способно минерализовать очень устойчивые вещества, содержащие в молекуле ароматические кольца. Используемый в работе азокроаситель Acid Orange 7 производится в мире в промышленном масштабе, широко применяется в различных отраслях и поэтому попадает в окружающую среду в значительных количествах. Предлагаемая работа состоит из четырех опытов, каждый их которых может быть выполнен как самостоятельное исследование. В качестве разрушаемого вещества может быть использован практически любой ксенобиотик, однако следует учитывать, что в этом случае период адаптации микроорганизмов активного ила к данному веществу может быть очень длительным (до нескольких лет).

Необходимые материалы и методы.

• 1. Материалы, оборудование, посуда (в расчете на 1 студента). Спектрофотометр Shimadzu UV-1202 (Япония) или аналогичный, кювета кварцевая с / = 0,5 см и кювета стеклянная с / = 1,0 см; газовый хроматограф Л ХМ 8 МД (модель 3, СССР) с катарометром или аналогичный; газовый хроматограф Chrom-5 (ЧССР) или аналогичный с пламенно-ионизационным детектором; хроматограф ВЭЖХ Du Pont (США) или аналогичный; световой микроскоп с масляным иммерсионным объективом 90Х; баллон с аргоном (азотом); щипцы для зажимания алюминиевых колпачков; центрифуга с гнездами для пробирок Эппендорф; манометр с иглой. Флаконы на 120 мл с герметичными резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками — 26 шт., пробирки химические мерные с притертыми пробками на 5—10 мл — 90 (45) шт., пластиковые пробирки Эппендорф на 2 мл с крышечками или аналогичные — 300 (150) шт., пипетки на 1—2 мл — 540 (270) шт., на 0,1 мл — 25 (13) шт., шприцы на 1—2 мл (лучше одноразовые) — 300 (150) шт., газовый шприц на 0,5—1,0 мл — 1 шт., предметные стекла для микроскопии — 50 (25) шт. Минеральная среда — 1100 мл, концентрированные растворы: азокрасителя — 50 мл, пирувата натрия — 10 мл, ацетата натрия — 20 мл, бромэтансульфоновой кислоты (БЭСК) — 10 мл; 50 мМ К-фосфатный буфер (pH = 7,0) — 100 мл, растворы, А и Б для определения аммония — по 30 мл, растворы А, В, С для определения сульфида — 30, 30 и 1,5 мл соответственно, 3N NaOH — 10 мл, реактив Бредфорда — 100 мл, краситель метиленовый синий для окрашивания микроскопических препаратов ~ 30 мл, иммерсионное масло кедровое ~ 5 мл.
• 2. Микробные ассоциации. В работе используют активный ил очистных сооружений, обрабатывающих бытовые и промышленные стоки.
• 3. Среды и растворы. Для всех опы тов применяют минеральную среду следующего состава (мг/л): МН₄С1 — 280, СаС1₂ • 2Н₂0 — 10, К₂НР0₄ — 250, MgS0₄ • 7Н₂0 — 100, ЭДТА — 1, NaIIC0₃ — 5000, дрожжевой экстракт — 100, концентрированный раствор микроэлементов — 1 мл. Такой раствор содержит (мг/мл): 11₃В0₃ — 0,05, FcCl₃ • 4П₂0 — 2, ZnCl₂ — 0,05, МпС1₂ • 4Н₂0 — 0,05, СиС1₂ • 2Н₂0 — 0,03, (NH₄)₂Se0₃ • 5Н₂0 — 0,05, А1С1₃ • 6Н₂0 — 2, NiCl₂ • 6Н₂0 — 0,05, Na₂Se0₃ • 5Н₂0 — 0,1. Минеральную среду кипятят для избавления от кислорода, затем охлаждают до комнатной температуры и разливают под током азота для предотвращения диффузии кислорода в среду. Среду разливают по 40—50 мл во флаконы объемом 120 мл, закрывают резиновыми пробками и зажимают алюминиевыми колпачками. Пузырьки со средой продувают азотом. Конечное давление во флаконах должно составить «1,6 атм. Пузырьки автоклавируют при 0,5 ати, pH среды после стерилизации равен 7,0. Все субстраты и добавки готовят в виде стерильных анаэробных концентрированных растворов и вносят по мере необходимости с помощью стерильных шприцев с соблюдением условий анаэробиоза.

Для приготовления концентрированного раствора азокрасителя его взвешивают в асептических условиях в рассчитанном количестве, переносят в стерильный пузырек, закрывают стерильной резиновой пробкой и зажимают алюминиевым колпачком. Затем во флакон добавляют стерильную дистиллированную воду до достижения нужной концентрации, продувают азотом и оставляют на 1—2 дня при комнатной температуре. Концентрированные растворы красителей могут образовывать осадок. Перед использованием такие растворы нагревают на водяной бане до полного растворения осадка, на что требуется от 2 до 10 мин. Концентрированные растворы ацетата, пирувата и бромэтансульфоновой кислоты готовят на дистиллированной воде, продувают азотом и стерилизуют при 0,5 ати.

Для разведения культуральной жидкости перед спектрофотометрическими измерениями используют нестерильный 50 мМ К-фосфатный буфер (pH = 7,0), приготовленный стандартным способом. Перед всеми измерениями культуральную жидкость освобождают от клеток центрифугированием при 15 тыс. g в течение 10 мин.

4. Определение концентраций азокрасителя и наличия его ароматических производных. Оптимум поглощения красителя Acid Orange 7 — 490 нм. Резкое снижение высоты основного пика в сочетании с появлением и увеличением высот пиков, соответствующих ароматическим составляющим красителя, свидетельствует о разрыве азосвязи в молекуле красителя и появлении в среде более простых ароматических соединений, которые в свою очередь также могут быть подвержены дальнейшему расщеплению микроорганизмами активного ила. Фрагментация азокрасителя визуально выражается в постепенном обесцвечивании культуральной жидкости. Спектрофотометрическое сканирование проводят в диапазоне длин волн 200—600 нм. Для анализа берут 100 мкл пробы жидкой фазы и доводят объем до 2 мл 50 мМ К-фосфатным буфером (pH = 7,0). Измерения осуществляют на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 или аналогичном, в кварцевой кювете с / = 0,5 см. Расчеты истинной концентрации азокрасителя проводят в соответствии с уравнением, полученным путем построения калибровочной кривой при содержании вещества от 10 до 500 мг/л:

где D — оптическая плотность данной пробы при 490 нм; N — разведение; X — тангенс угла наклона калибровочной кривой; М — молекулярная масса азокрасителя (350,32).

5. Определение количества метана, углекислоты и молекулярного водорода. Метан и углекислота являются конечными продуктами биодеградации азокрасителя, а молекулярный водород — промежуточный продукт, регистрирующийся только на начальных стадиях деструкции ксенобиотика, пока в микробном сообществе не сбалансирован обмен веществ. Концентрации газов определяют на газовом хроматографе ЛХМ 8 МД (модель 3) с катарометром или аналогичном, газ-носитель — аргон, скорость которого 20 мл/мин. Колонки длиной 2 м заполнены порапаком QS. Предварительно измеряют давление (в атм) во флаконах с помощью манометра, на входное отверстие которого укреплена игла от шприца. Для каждого анализа с помощью газового шприца на 0,5—1,0 мл берут пробу газа 0,2 мл. При температуре термостата колонок 50 °C пик водорода регистрируется через 65 с, метана — через 112 с, С0₂ — через 185 с. Количества газов рассчитывают следующим образом:

где D — содержание данного газа в газовой фазе в объемных процентах; V_M — объем 1 моля газа; Р — давление в сосуде, атм; Р₀ — давление при нормальных условиях (1 атм); Т₀ — температура при нормальных условиях.

(273 К); Т — температура культивирования, К; V_{r (}j, — объем газовой фазы в сосуде; И_Жф — объем жидкой фазы в сосуде.

Величину D рассчитывают по высотам хроматографических пиков, так как они довольно узки (обычно расчеты делают по площадям поверхности иод пиком): высоту пика для данного газа в мм делят на 100 и на тангенс угла наклона калибровочной кривой. При проведении расчетов следует учитывать чувствительность прибора при измерении данной пробы.

Калибровочные кривые получают следующим образом: флаконы емкостью 10 мл заполняют аргоном и закрывают их герметично резиновыми пробками, предусматривающими отбор проб газа. В эти флаконы газовым шприцем добавляют нужный объем анализируемого газа, чтобы его содержание составляло: 0,5—96% для метана, 0,5—100% для водорода и 1 — 100% для углекислого газа. Из каждого флакона отбирают три пробы по 0,2 мл и фиксируют высоту хроматографического пика для анализируемого газа. Полученные данные усредняют и осуществляют построение калибровочной кривой в координатах: содержание газа (% по объему) — высота пика (мм).

6. Определение ацетата и других летучих жирных кислот (ЛЖК) и спиртов. Интермедиатами анаэробного распада азокрасителей и ароматических аминов являются ЛЖК и спирты с длиной углеводородного скелета не более 6 атомов, концентрацию которых определяют на газовом хроматографе Chrom-5 с пламенно-ионизационным детектором или аналогичном, на колонке 1 м, заполненной хромосорбом 101. Скорость газаносителя (аргона) — 30 мл/мин. Для каждого анализа берут пробу жидкой фазы 1 мкл, подкисленную соляной кислотой. При температуре термостата колонок 200 °C происходит четкое разделение продуктов, идентифицируемых по временам удержания соответствующих соединений в стандартных растворах. Расчет концентрации каждого вещества в мМ проводят, но высоте пика, отнесенной к высоте пика этого вещества в стандартном растворе:

где h — высота пика в пробе или стандартном растворе; N — чувствительность прибора при соответствующем измерении; С — концентрация вещества в соответствующем растворе.

• 7. Определение концентрации ароматических интермедиатов и продуктов их дальнейшего преобразования. Исходя из химической формулы азокрасителя, возможного пути его фрагментации и максимумов поглощения пиков продуктов при спектрофотометрическом сканировании подбирают в качестве стандартов соответствующие амины и другие ароматические соединения. Идентификацию веществ и определение их концентрации проводят при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Du Pont или аналогичном, используя колонку с обращенной фазой Диасорб 130-С₁₆Т, 6р в системе уксусная кислота (1%) — метанол (в соотношении 85: 15 по объему). В качестве детектора используют спектрофотометр, настроенный на длин}' волны
• 225 нм (средняя длина волны поглощения ароматических соединений). Скорость подачи элюснта — 1 мл/мин, давление — 148 атм. Объем вводимой пробы — 20 мкл. До проведения анализа отобранные пробы могут храниться при -20°С в течение 30 сут. в закрытых пластиковых пробирках Эппендорф. Ароматические вещества определяют по соответствию их времен удержания временам удержания стандартных растворов, а расчет концентрации компонентов смеси ведут по площадям пиков, отнесенным к площадям пиков веществ в стандартных растворах.
• 8. Определение концентрации иона аммония. Концентрацию ионов аммония определяют по методу Фоссета и Скотта. Для этого готовят реактив Фоссета, состоящий из двух растворов. Раствор, А (г/л): фенол — 10, нитропруссид натрия — 0,05. Раствор Б (г/л): Na₂HP0₄ — 37, NaOH — 10, 1% раствор гипохлорита натрия (NaOCl) — 10 мл. Для определения концентрации аммония в жидкой фазе 200 мкл исследуемого раствора помещают в мерную пробирку, разбавляют водой до 400 мкл, затем добавляют 0,8 мл раствора, А и 0,8 мл раствора Б и интенсивно перемешивают. Растворы инкубируют 30 мин при 37 °C, а затем сразу измеряют оптическую плотность при 578 им и / = 1 см. В качестве контроля используют раствор, не содержащий аммония. По калибровочной кривой (от 1 до 15 мг/л NHJ) определяют содержание аммония в исследуемом растворе. При необходимости растворы, А и Б можно хранить в сосудах из темного стекла не более 2 мес.
• 9. Определение концентрации сульфида. Исходный азокраситель содержит в своем составе сульфогруппу, поэтому можно ожидать появления иона сульфида в процессе анаэробной биодеструкции. Концентрацию сульфид-иона определяют по методу Трюпера и Шлегеля с использованием трех растворов, содержащих в 100 мл каждого раствора. Раствор А: ацетат цинка — 4 г, ледяная уксусная кислота — 0,05 мл. Раствор В: 2-диметил-и-фенилендиамин сульфат — 0,2 г, H₂S0₄ (конц.) — 20 г. Раствор С: Fe (NHS0₄)₂ — 10 г, H₂S0₄ (конц.) — 2 г. К 100 мкл раствора, А в пластиковой пробирке Эппендорф быстро добавляют 10 мкл пробы и 785 мкл дистиллированной воды. Затем в смесь вносят 100 мкл раствора В и 5 мкл раствора С. Через 10 мин измеряют поглощение образовавшегося хромогенного комплекса при 660 нм и / = 1 см. По калибровочной кривой (от 100 до 500 мкг/мл S²") определяют содержание сульфида в исследуемом растворе. В качестве контроля используют воду.
• 10. Определение белка. Прирост биомассы микроорганизмов оценивают по общему содержанию белка в среде, которое определяют методом Бредфорд. Для анализа отбирают пробу жидкой фазы объемом 0,3 мл, центрифугируют в течение 15 мин при 12 тыс. g, удаляют надосадочную жидкость. К осадку добавляют 0,3 мл щелочи (3N NaOH) и выдерживают при 30 °C в течение 12 ч. При определении содержания белка в пробирки вносят по 200 мкл пробы, добавляют по 2 мл реактива Бредфорд, перемешивают и через 20 мин измеряют оптическую плотность при 595 нм. Пользуясь калибровочной кривой, определяют концентрацию белка в исследуемых растворах. Калибровочную кривую строят, используя бычий сывороточный альбумин, высушенный в эксикаторе до постоянного веса, из которого готовят растворы с концентрацией белка от 10 до 100 мкг/мл. Растворы затем обрабатывают, как было описано выше, и строят зависимость оптической плотности от концентрации белка.
• 11. Микроскопия. Для анализа изменений микроскопической картины микробного сообщества готовят фиксированные окрашенные препараты и просматривают их с иммерсионной системой в световом микроскопе.

Условия проведения экспериментов.

На предварительном этапе работы рассчитывают необходимые количества реактивов для приготовления концентрированных растворов. При этом следует учитывать, что итоговая концентрация субстратов и добавок в среде должна составить: пирувата натрия — 3 мМ, ацетата натрия — 6 мМ, бромэтансульфоновой кислоты — 45 мМ и азокрасителя в разных вариантах опыта — 0,7; 1,4; 2,1; 2,8 и 3,5 мМ. Каждая добавка должна быть внесена в объеме, не превышающем 1 мл. Снимают полный спектр раствора азокрасителя (концентрация 300 мг/л) в диапазоне длин волн 200—600 нм (рис. 14.9).

Acid Orange 7, С. I. 15 510 (Orange II,.

Tropaeolin ООО Nr. 2,.

Кислотный оранжевый) Молекулярная масса 350,32 Максимум поглощения — при 490 нм.

Рис. 14.9. Характеристики азокрасителя Acid Orange 7.

Затем осуществляют построение калибровочных кривых для всех измеряемых соединений.

В пузырьки со средой стерильно вносят активный ил из расчета 10% по объему и необходимые добавки. В качестве контрольных используют следующие варианты:

• 1) пузырьки без активного ила с добавлением азокрасителя в концентрации 0,7 мМ для регистрации возможных физико-химических преобразований субстрата в минеральной среде (без участия биологической активности);
• 2) пузырьки без красителя, но с активным илом для учета выделения метана за счет лизиса инокулята;
• 3) флаконы, содержащие ил, предварительно инактивированный автоклавированием при 0,5 ати («убитый ил»), для выявления роли адсорбции азокрасителя на матрикс ила. Полный набор вариантов опыта представлен на рис. 14.10. Каждый вариант ставят в двух повторностях.

Рис. 14.10. Варианты опыта:

АИ — активный ил; АК — азокраситель; Ац — ацетат; П — пируват; БЭСК — бромэтансульфоновая кислота; скобки и рамки объединяют варианты, учитываемые в различных экспериментах Культивирование всех вариантов проводят в статических условиях (без перемешивания) в темноте при 30 °C. Отбор проб жидкой (0,8 мл) и газовой (0,2 мл) фазы осуществляют в нулевой точке и каждые 24 ч (48 ч) стерильными шприцами, без нарушения анаэробиоза.

В эксперименте по биоразлагаемости (1 на рис. 14.10) сравнивают изменение концентраций азокрасителя, промежуточных (Н₂, ароматических аминов, ацетата и др. ЛЖК и спиртов) и конечных (метана, углекислоты, аммония и сульфида) продуктов, а также прирост биомассы в опытном и трех контрольных вариантах. Выявленные ароматические интермедиаты определяют с помощью ВЭЖХ и по максимумам поглощения при спектрофотометрии. Описывают характерные культуральные свойства и микроскопическую картину сообществ из разных вариантов. Полученные данные представляют в виде таблиц, спектров азокрасителя и ароматических производных, а также графиков зависимости содержания всех вышеперечисленных веществ (в мМ) и биомассы (в мг/л) от времени (в сут.). Делают выводы о биологической природе процесса, роли адсорбции, последовательности появления и химической структуре ароматических интермедиатов, а также о возможных механизмах конверсии азокрасителя. Анализируют соответствие различных фаз процесса биодеструкции азокрасителя изменениям в микробном составе анаэробной ассоциации.

В эксперименте по изучению влияния дополнительного источника углерода — нирувата (2 на рис. 14.10) сравнивают те же параметры, что и в предыдущем эксперименте, но во флаконах с активным илом и азокрасителем с или без нирувата. Данные представляют в виде таблиц и графиков, делают выводы об изменении хода процесса биодеструкции красителя в присутствии легкодоступного субстрата (увеличении скорости, изменении состава и соотношения продуктов, приросте биомассы, изменении микроскопической картины активного ила).

Для накопления и определения интермедиатов распада азокрасителя проводят эксперимент по элиминированию последней стадии биодеградации в анаэробных условиях — метанообразования (3 на рис. 14.10). Во флаконы с активным илом и азокрасителем, содержащие и не содержащие дополнительный источник углерода пируват, вносят ингибитор метанообразования — бромэтансульфоновую кислоту (БЭСК) в концентрации 45 мМ. За процессом следят по виду спектра культуральной жидкости, хроматограммы ВЭЖХ, накоплению интермедиатов в жидкой фазе. Определяют морфологические и культуральные изменения в разных вариантах. Результаты представляют в виде таблиц и графиков. Уточняют данные о химической структуре кольцевых и линейных интермедиатов. Делают выводы о влиянии метаногенной стадии на скорость процесса биодеградации азокрасителя в условиях, когда он является единственным источником углерода и энергии или имеется также другой легкодоступный субстрат.

Исследование токсичности азокрасителя (4 на рис. 14.10) проводят на фоне стандартного метода определения ацетокластической метаногенной активности анаэробной биомассы. Во все пузырьки вносят раствор ацетата натрия до конечной концентрации 6 мМ в качестве основного субстрата и азокраситель, конечная концентрация которого должна составить 0,7; 1,4; 2,1; 2,8 и 3,5 мМ. В качестве контрольных используют пузырьки без добавления азокрасителя. Через каждые 24 ч (48 ч) измеряют концентрацию метана в газовой фазе, а полученные результаты представляют в виде графика зависимости количества метана от времени. Измерения сопровождают приготовлением фиксированных окрашенных препаратов культуральной жидкости. Значение ацетокластической активности анаэробного ила рассчитывают по тангенсу угла наклона линейного участка этой кривой. За 100% активности принимают тангенс угла наклона линейного участка кривой зависимости концентрации метана от времени в эксперименте без добавления азокрасителя. Поскольку скорость разложения самого азокрасителя в этих условиях существенно ниже скорости ацетокластической реакции, его вкладом в образование метана можно пренебречь. Результаты представляют в виде графиков зависимости ацетокластического метаногенеза от времени для разных концентраций красителя, а также кривой зависимости образования метана (в %) от концентрации азокрасителя (в мМ). Определяют ЛД-₎₀ для данного азокрасителя и делают вывод о его токсичности по отношению к метаногенной активности анаэробного ила. Анализируют изменение микроскопической картины в зависимости от концентрации красителя и делают вывод об изменении микробного состава активного ила при увеличении «давления» ксенобиотика.

Рекомендуемый план проведения работы и приблизительная длительность операций Занятие 1.

Подготовка и стерилизация минеральной среды. Расчет необходимых количеств веществ для приготовления концентрированных растворов азокрасителя и добавок. Приготовление и стерилизация растворов добавок и инструментов (4 ч). Приготовление концентрированного раствора азокрасителя (48 ч).

Занятие 2.

Приготовление реактивов, растворов и стандартов для определения необходимых веществ. Построение калибровочных кривых и снятие спектра раствора азокрасителя (4 ч).

Занятие 3.

Засев флаконов активным илом, внесение субстрата и необходимых добавок. Отбор проб в нулевой точке и проведение всех необходимых определений. Описание культуральных признаков и приготовление фиксированных окрашенных препаратов (4 ч). Инкубация посевов (20 сут.).

Занятия 4—13.

Отбор проб каждые 24 ч (48 ч). Описание культуральных признаков и приготовление фиксированных окрашенных препаратов. Проведение необходимых определений. Занесение результатов в таблицы. Закладка на хранение проб для ВЭЖХ (4 ч).

Занятие 14.

Отбор и приготовление стандартов для ВЭЖХ. Проведение ВЭЖХ для всех хранящихся проб (8 ч).

Занятие 15.

Оформление результатов (4 ч).