Основные методы in vitro в селекции растений

Соматическая гибридизация — создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем; вызывать слияние трех и более родительских клеток; получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей, наряду или с несколькими хромосомами или генами, или только с органеллами и цитоплазмой другого родителя. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Выделение, культивирование и слияние изолированных протопластов. Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения.

Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой питательных сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС1₂. В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку (через 48 ч с момента выделения протопластов) и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой.

Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но это случается довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Э. Коккинга в 1970 г. В качестве индуктора служил нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким pH (9−11) и высокой концентрацией ионов кальция (100−300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500−6000. У. Циммерман с сотрудниками разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока.

Слияние протопластов приводит к образованию либо цибрида, либо гибрида. Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро — одного. Это возможно, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения. Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам.

Гибриды были получены при слиянии протопластов эритроцитов крысы и протопластов дрожжевых клеток, протопластов моркови и человека, табака и человека и др.

Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений был получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca и N. langsdorfii.

В настоящее время получено большое число межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов методом парасексуальной гибридизации. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные этим методом, в той или иной степени анормальны. Примером может служить соматический гибрид арабидопсиса и турнепса, который является растением-монстром. Аномалии возникают как результат хромосомной несбалансированности.

Для идентификации гибридов могут быть использованы пластиды (протопласты). Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовали зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови.

Применение изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы; следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер, в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты и получить растения-регенеранты.

Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только начинают развиваться. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки открывает новые перспективы перед клеточной селекцией.

Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro — создание технологий для сельского хозяйства на основе следующих методов клеточной селекции:

• — прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный искомый мутантный тип клеток;
• — непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели неустойчивых делящихся клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений;
• — тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;
• — визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.).

Наиболее распространен метод прямой селекции. Он применяется главным образом для выделения растений-регенерантов, устойчивых, например, к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другим антиметаболитам.

Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования.

Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований.

Вместе с тем многие исследователи, работающие с каллусными культурами, отмечают существенные недостатки данного объекта: медленный рост ткани; неравноценное для всех клеток воздействие токсических веществ, применяемых в качестве селективного фактора; потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток.

Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура или протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечисленные недостатки, с которыми сталкиваются исследователи при использовании каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным.

Получение стабильно устойчивых линий — процесс длительный. Как правило, селекция начинается с получения из изолированных растительных эксплантов достаточного количества каллусной массы, которая в дальнейшем используется для определения такой концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается рост каллусной ткани и одновременно погибает часть каллусных колоний. Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах.

Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и могут быть генетически неустойчивыми, то в течение последующих четырех — шести субкультивирований на селективной среде проверяется стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их переносят на питательную среду без селективного фактора и субкультивируют еще два-три пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растения-регенеранты.

Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным концентрациям солей, а также к токсинам, выделенным из грибов — возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, для устойчивости к гербицидам, к высоким концентрациям алюминия и другим факторам.

Большое число работ по культивированию каллуса с целью получения нового селекционного материала проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне. Уже достигнуты первые положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCl. Получены клетки моркови, а из них — растения, которые, благодаря добавлению в питательную среду токсичных аналогов аминокислот, синтезируют в 20 раз больше метионина, в 30 раз больше — триптофана, в пять раз больше — лизина. Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили. Что касается древесных растений, то работы в этом направлении крайне редки и часто носят поисковый характер.

Дальнейшее использование каллусной культуры в селекционных целях открывает огромные возможности в создании новых форм растений, несущих ценные для человечества признаки.

Наряду с перечисленными выше объектами (каллусные и суспензионные культуры, изолированные протопласты), в качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а также культура изолированных зародышей. Например, путем культивирования и селекции in vitro зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот и с улучшенным содержанием белка. Для картофеля разработан эффективный метод обработки побегов и черенков мутагеном, приводивший к получению химерных мутантов хлорофиллдефектности и антибиотикоустойчивости. При культивировании пыльников яровой пшеницы сортов Саратовская 29 и Московская 35 на питательных средах с повышенным содержанием солей хлорида натрия получены соматические эмбриоиды, а в дальнейшем — растения-регенеранты, проявившие повышенную солеустойчивость.

Таким образом, проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в два — четыре раза быстрее по сравнению с традиционными способами.