Азотфиксация свободноживущими микроорганизмами

Род Clostridium. Первым из свободноживущих азотфиксаторов был открытый С. Н. Виноградским в 1893 г. Clostridium pasteurianum. Это анаэробная бактерия, вызывающая маслянокислос брожение, имест палочковидные клетки длиной 1,5—8 мкм и шириной 0,8—1,3 мкм. Молодые клетки несут перитрихально расположенные жгутики, в старых образуются споры. При спорообразовании клетки утолщаются посередине или на конце. В присутствии кислорода воздуха С. paste и папит может развиваться только при наличии в среде аэробных бактерий, поглощающих кислород; организм малочувствителен к реакции среды и встречается как в кислых (pH 4,5—5,5), так и в щелочных (pH 8—9) почвах.

Источником азотного питания для бактерий рода Clostridium могут служить соли аммония, азотной кислоты и многие содержащие азот органические соединения. При отсутствии указанных соединений бактерии усваивают молекулярный азот. Источником углерода для С. pasteurianum может быть широкий набор углеродсодержащих соединений — моносахариды, дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал) и органические кислоты. Развиваясь на питательных средах, содержащих углеводы, С. pasteurianum разлагает их с образованием масляной и уксусной кислот, диоксида углерода и водорода. Освобождающаяся при сбраживании углеводов энергия частично идет на усвоение молекулярного азота атмосферы.

С. pasteurianum обычно считался слабоактивным фиксатором азота. Пределом его активности было связывание 1—3 мг азота на 1 г сброженного сахара. Однако, используя питательные среды, наиболее отвечающие физиологическим потребностям С. pasteurianum, его активность удалось повысить до 10—12 мг азота на 1 г сброженного сахара, в некоторых случаях и более.

Способность фиксировать азот атмосферы свойственна и другим видам рода Clostridium (С. butyricum, С. acetobutylicum, С. pectinovorurn, C. felsineum и т. д.).

Род Azotobacter. Голландский микробиолог М. Бейеринк в 1901 г. открыл аэробную бактерию, также усваивающую молекулярный азот — Azotobacter chroococcum (сем. Azotobacteriaceae). Молодые клетки азотобактера представляют собой палочки размером 2—3×4— 6 мкм. Позже они превращаются в крупные кокки диаметром до 4 мкм. Кокковидные клетки обычно покрыты капсулой и содержат разные включения (жир, крахмал, поли-р-гидроксимасляную кислоту и др.).

У кокковидных клеток некоторых видов азотобактера появляется толстая оболочка, и они превращаются в цисты. На одних питательных средах палочки быстро приобретают кокковидную форму, на других — лишь по истечении длительного времени. Палочковидные клетки азотобактера имеют жгутики и обладают подвижностью (рис. 43). При переходе палочек в кокки жгутики обычно теряются.

Из описанных видов азотобактера наиболее изучены: A. chroococcum, A. beijerinckii, A. vinelandii и A. paspali. Перечисленные виды различают по размерам и форме клетки, а также по некоторым дру;

Рис. 43. Клетки бактерий рода Azotobacter: делящиеся клетки со жгутиками A. agilis (A) и A. macrocytogenes (Б); В— кокконилныс. окруженные слизистой капсулой, клетки A. vinelandii (по: Енсен) гим признакам, в частности пигментации колоний. Так, колонии A. chroococcum имеют бурый, почти черный цвет, A. vinelandii выделяют желтый пигмент с зеленой флуоресценцией, A. paspali также продуцируют желтый пигмент. В почвах чаще всего встречается Azotobacter chroococcum.

Все виды азотобактера являются аэробами. Источником азота для них могут служить соли аммония, нитриты, нитраты и аминокислоты. В отсутствие связанных форм азота азотобактер фиксирует молекулярный азот. Небольшие дозы азотсодержащих соединений не приводят к депрессии фиксации азота, а иногда даже стимулируют ее. Увеличение количества связанного азота в среде полностью подавляет усвоение молекулярного азота. Энергия усвоения азота у отдельных культур азотобактера колеблется в широком диапазоне. Активные культуры связывают 15—20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества.

Азотобактер способен использовать большой набор органических соединений — монои дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал), многие спирты, органические кислоты, в том числе ароматические. Вообще азотобактер проявляет высокую потребность в органических веществах, поэтому в больших количествах встречается в хорошо удобренных почвах.

Для роста бактерии нуждаются в элементах минерального питания, особенно в фосфоре и кальции. Потребность азотобактера в данных элементах столь значительна, что его используют как биологический индикатор на наличие фосфора и кальция в почве. Для энергичной азотфиксации микроорганизмам требуются микроэлементы, из них наиболее важен молибден, который входит в состав ферментов, катализуюших процесс усвоения азота.

Отмеченные физиологические особенности характеризуют экологию данного организма. Азотобактер обитает в высокоплодородных, достаточно влажных почвах с нейтральной или близкой к ней реакцией среды. При недостаточной влажности большинство клеток отмирает. В черноземных, каштановых и сероземных почвах, благоприятных для рассматриваемого микроорганизма, его обнаруживают в значительных количествах только весной. При летнем иссушении почвы остаются единичные клетки. В зоне подзолистых и дерново-подзолистых почв азотобактер можно найти в огородных и пойменных почвах, богатых органическими соединениями, с оптимальным pH 6,8—7,2.

Другие свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы. К семейству Azotobacteriaceae относят и азотфиксируюших бактерий рода Azomonas — A. agi/is, A. ins ignis и A. macrocytogenes. Первые два вида обитают в водоемах, третий — в почвах. Виды Azomonas близки к азотобактеру, отличаются от него рядом морфологических и физиологических особенностей. Для A. agi/is характерны относительно крупные, овальные клетки с перитрихальным жгутикованием, для A. insignis также крупные, но более округлые клетки, с полярными или лофотрихальными жгутиками, для A. macrocytogenes — клетки размером 8—10 мкм с одним полярным жгутиком. Образуют колонии с розоватым пигментом, который флуоресцирует в ультрафиолетовых лучах.

Представители рода Azomonas — аэробы. В отличие от азотобактера они могут расти и фиксировать азот при pH 4,6—6,9 и даже 4,3. Источник углерода для этих бактерий — углеводы, спирты, органические кислоты. Достаточно эффективно виды Azomonas связывают азот атмосферы (до 15—18 мг N₂ на 1 г использованного сахара). Распространены в тропических почвах.

К этому же семейству относятся и бактерии рода Beijerinckia, близкие по свойствам к азотобактеру. От азотобактера они отличаются значительной кислотоустойчивостью, кальцифобностью и некоторыми другими свойствами. Они могут расти и фиксировать азот даже в среде с pH 3,9. Аэробы.

Впервые бактерии рода Beijerinckia выделены из кислых тропических почв (pH 4,5—5,2) Малайзии, Бангладеш и Бирмы. Описан ряд видов бактерий данного рода — В. indica, В. mobilis, В. flu— minensis, В. derxii.

Клетки Beijerinckia могут быть палочковидной, овальной или круглой формы. У одних видов клетки подвижны, у других — неподвижны. Иногда наблюдается образование капсул. Цисты и эндоспоры отсутствуют.

Большинство культур бактерий рода Beijerinckia формируют на бсзазотистой среде с глюкозой выпуклые, блестящие, нередко складчатые слизистые колонии вязкой консистенции. При старении колонии окрашиваются в красноватый или темно-коричневый цвет. В отличие от азотобактера виды Beijerinckia не усваивают ароматические соединения и хуже ассимилируют органические кислоты. При развитии на среде с углеводами накапливаются кислые продукты (уксусная и другие органические кислоты).

Бактерии рода Beijerinckia менее требовательны по сравнению с азотобактером к концентрации фосфорных соединений в среде. Даже небольшие дозы соединений кальция тормозят рост представителей данного рода. Они значительно менее, чем азотобактер, чувствительны к повышенной концентрации солей железа и алюминия, нуждаются в молибдене, но также довольствуются меньшими его дозами. Эти свободноживущие азотфиксаторы фиксируют 18— 20 мг азота на I г использованного сахара.

Бактерии рода Beijerinckia широко распространены в кислых почвах субтропической и тропической зон. Реже встречаются в почвах зоны умеренного климата. В окультуренных кислых почвах содержится больше клеток Beijerinckia, чем в целинных. Целинные луговые почвы богаче бактериями рода Beijerinckia, чем лесные.

К свободноживущим фиксаторам молекулярного азота семейства Azotobacteriaceae относятся также виды рода Derxia, выделенные из почв Индии с pH 6,5. Это медленно растушие на безазотистых средах палочковидные бактерии со слизистыми капсулами, обладающие на определенной стадии развития жгутиками. Колонии могут быть пленочными или слизистыми, при старении приобретают желтовато-коричневый цвет. Derxia используют различные источники углерода — моно-, ди-, полисахариды, спирты, органические кислоты, в среде без азота фиксируют 12—15 мг N₂ на I г использованного сахара.

Представитель данного рода — Derxia gummosa — развивается в почвах с pH 4,5—6,5, однако лучше растет при pH 5,1—5,5. Виды данного рода распространены в почвах тропической зоны — Индии, Индонезии, тропической Африки. Южной Америки.

До половины XX в. считали, что связывать молекулярный азот могут лишь отдельные специализированные виды микроорганизмов, относящиеся в основном к родам Clostridium и Azotobacter. Однако положение существенно изменилось, когда для выявления азотфиксаторов вместо метода Кьельдаля стати использовать изотропный метод (ⁱ⁵N₂), а также ацетиленовый метод (реакция восстановления ацетилена в этилен), выявляющий у бактерий нигрогеназу — ферментный комплекс, обеспечивающий фиксацию молекулярного азота. Последний метод более чем в I0⁵ раз чувствительнее метода Кьельдаля и в 10³ раз — метода изотопных индикаторов (^l5N₂).

В результате применения новых методов было установлено, что функция фиксации молекулярного азота присуща и многим другим микроорганизмам: фототрофным бактериям, цианобактериям, хемолитоавтотрофным бактериям, мстилотрофным, сульфатвосстанавливаюшим, метаногенам и др. Известно уже более ста видов микроорганизмов, обладающих способностью к фиксации азота атмосферы.

В воде рисовых полей, в различных водоемах распространены азотфиксирующие анаэробные фототрофные пурпурные серобактерии (Chromatium, Thiocapsa, Thiocystis и др.), пурпурные несерные бактерии (Rhodospirillum, Rhodopseudomonas и др.) и зеленые серобактерии (Chlorobium, Pelodictyon и др.).

Аэробные цианобактерии, обладающие гетероцистами (клетки с толстой клеточной стенкой), способны фиксировать N₂. Среди них преобладают представители родов Nostoc, Anabaena, Calothrix, Cylindrospermum, Toly pothrix, Scytonema и др. В почвах обнаружено более 130 видов гетероцистных форм цианобактерий. Наиболее широко распространены в почвах представители рода Nostoc.

Усвоение молекулярного азота у цианобактерий происходит в гстсроцистах, т. е. в клетках, куда ограничен доступ кислорода. Однако ферментный аппарат, связывающий N₂, обнаружен и в вегетативных клетках. Это дало основание для поиска негетероцистных азотфиксирующих форм. В последнее время они найдены — это представители родов Synechocystis, Synechococcus, Chroococcidiopsis, Oscillatoria, Lyngbya, Microcoleus, которые, не обладая гетероцистами, могут связывать N₂.

Цианобактерии распространены во всех почвенно-климатических зонах, однако лучше развиваются в почвах с нейтральной реакцией среды. Поэтому численность и видовой состав описываемых азотфиксаторов значительно возрастают в нейтральных почвах южной зоны. Отдельные виды приурочены к определенным местам обитания. Многие цианобактерии живут в симбиозе с другими растительными организмами, например с грибами, образуя лишайники. Адаптируясь к местным условиям, эти бактерии приобрели способность фиксировать азот при температуре, близкой к 0 °C; иногда азотфиксация происходит даже при -5 °С, оптимальная температура для процесса 15—20 °С.

Некоторые цианобактерии способны фиксировать азот в симбиозе с высшими растениями. Так, у водного папоротника Azo/la, который растет на поверхности затопленных рисовых полей, в полостях листьев обитает Anabaena azollae. Накопление азота в почве в результате симбиоза Anabaena с Azolla может достигать 300 кг/га в год. Подобного рода симбиоз обнаружен между печеночниками (Blasia pusilla, Anthoceros punctatus, Peltigera sp.) и Nostoc. В нижней части ствола, в специальных железах у мест отхождения листовых черешков тропического кустарника Gunnera macrophylla обитают симбиотические азотфиксирующие цианобактерии Nostoc punctiforme. Данный вид имеет гетероцисты и синтезирует нитрогеназу.

Наибольшее значение фототрофные анаэробные бактерии и цианобактерии имеют главным образом в переувлажненных и затопленных почвах (болота, рисовники и т. д.), где они могут связывать до 20—50 кг/га азота в год.

В затопляемых почвах рисовых полей при разложении растительных остатков образуются газообразные соединения — Н₂, СН₄, С0₂, которые могут служить источниками энергии для некоторых азотфиксирующих бактерий. Например, Corynebacterium autotrophiсит окисляет водород и ассимилирует С0₂, т. е. способна к хемолитоавтотрофии и одновременно к фиксации азота атмосферы.

Способность к азотфиксации имеется и у метилотрофных бактерий родов Methylomonas, Methylobacterium и Methy/ococcus, которые в аэробных условиях могут жить, окисляя только метан или метиловый спирт. Известны анаэробные сульфатвосстаиавливающие бактерии-азотфиксаторы. относящиеся к родам Desulfotomaculum и Desulfovibrio. Такие бактерии широко распространены в водоемах и почвах, где в анаэробных условиях идет микробное разложение растительных и животных остатков. Выделены, описаны и многие другие свободноживушие азотфиксирующие бактерии.

Суммарная деятельность свободноживущих бактерий в природных субстратах, в частности в почвах, приводит к накоплению азота. Так, в пахотные почвы зоны умеренного климата за счет свободноживущих азотфиксаторов ежегодно поступает от 26 до 86 кг/га азота в год, в почвы тропической зоны — до 100 и более. Считают, что в среднем в пахотных почвах России свободноживушие азотфиксаторы связывают до 20 кг/га азота в год.