Альтернативные способы подбора матричной структуры

«Сумеречная зона» при выравнивании аминокислотных последовательностей. Ранее мы рассмотрели подходы, позволяющие производить поиск пар белков, обладающих сходными пространственными структурами и одновременно определенным сходством аминокислотных последовательностей. С помощью самых простых методов, таких как точечные графики, возможно уверенно идентифицировать только пары последовательностей, имеющих явную гомологию. Выравнивание аминокислотных последовательностей, в том числе и метод BLAST, дает возможность уверенно обнаруживать нары последовательностей с идентичностью не ниже 35—40% и, в отличие от точечных графиков, позволяет производить статистическую оценку достоверности получаемых выравниваний.

Следующим этапом, понижающим планку идентичности обнаруживаемых пар последовательностей до 25—30%, можно считать подходы, использующие профили аминокислотных последовательностей. Однако для использования только аминокислотных последовательностей есть естественный предел — область идентичности ниже 25% называют «сумеречной зоной выравниваний» {twilight zone). Для белков с аминокислотными последовательностями, идентичными не менее чем на 25%, мы не можем, проведя выравнивание, сколько-нибудь достоверно утверждать о сходстве или различии пространственных структур.

Распознавание укладки белковой молекулы. 30(Ш)-профили. Основой для применения методов выравнивания аминокислотных последовательностей, а также методов выравнивания профилей аминокислотных последовательностей для сравнительного моделирования является тот факт, что белки со сходными аминокислотными последовательностями обладают близкими пространственными структурами. Однако по мере накопления информации о пространственных структурах белков стало известно, что для большинства белков, обладающих похожими пространственными структурами, коэффициент идентичности последовательностей составляет 7—15% (рис. 3.42).

Рис. 3.42. Зависимость количества пар белковых доменов, имеющих похожую укладку молекулы, от коэффициента идентичности последовательностей.

Еще одна особенность всего многообразия белков состоит в том, что количество возможных (встречаемых в природе) укладок белковых молекул (доменов) ограничено (рис. 3.43) и оценивается в районе от полутора до нескольких тысяч.

На протяжении последних 10—15 лет активно разрабатываются методы поиска белков, имеющих предположительно сходные пространственные структуры, но при этом не обладающих похожими последовательностями, т. е. имеющих идентичность менее 30%. Такой подход получил название распознавания укладки молекулы (fold recognition).

Рис. ЗАЗ. Количество типов укладок молекулы, суперсемейств, семейств и индивидуальных структур (/10) белков, по данным базы SCOP, по годам:

-?— укладок; —•—суперсемейств; - — семейств; —*—структур/10.

Видно что, скорость роста числа типов укладок структур отстает от скорости роста числа отдельных структур Наиболее простым переходом от методов выравнивания последовательностей к методам распознавания укладки является рассмотрение 3D (1D) — профилей структур. Этого можно добиться, обозначив каждую позицию структуры символами А_ь А₂,…, A_N. При этом для каждой позиции профиля мы можем произвести некоторое описание, так называемый класс окружения (environment class), например, на основе таких характеристик, как вторичная структура и гидрофобность/гидрофильность окружения. Другими словами, для каждой позиции вместо конкретной аминокислоты будет указан тип символа профиля, например: а-спираль, гидрофильное окружение. На рис. 3.44 представлен процесс построения профиля для окружения, характеризуемого тремя параметрами: доступностью боковой цепи остатка для молекул растворителя, вторичной структурой участка и полярностью атомов, окружающих боковую цепь остатка.

Выравнивание исследуемой аминокислотной последовательности с профилем структуры происходит так же, как и выравнивание с профилем последовательности. Кроме того, существуют методы, применяющие предсказание вторичной структуры и параметров окружения для исследуемой последовательности перед выравниванием, в этом случае производится выравнивание типа «профиль (предсказанный) — профиль (структурный)».

Рис. 3.44. Процесс построения профиля:

а — характеризуется структура конкретного белка, и каждому остатку присваивается класс окружения; б — на основании большого количества похожих структур генерируется профиль, который отражает соответствие каждого тина остатка окружению Трединг. Основное направление в разработке методов поиска белков, имеющих предположительно сходные пространственные структуры, но при этом не обладающих похожими последовательностями, получило название трединга (англ, threading — протягивание). Данное название появилось из-за того, что первый метод, положивший начало этому направлению, предлагал «протягивать» исследуемую последовательность через каркасы известных белковых структур, определяя таким образом структуры, «оптимально» подходящие данной последовательности (рис. 3.45).

Рис. 3.45. Общая схема, характеризующая подход трединга к распознаванию укладки молекулы:

алгоритм оперирует банком известных пространственных структур белковых молекул (нижний ряд). Обычно используется только скелет структуры без боковых цепей остатков. Исследуемая последовательность (протягивается) накладывается на известные пространственные структуры (верхний ряд).

При этом часть участков последовательности укладывается в скелет (сплошная толстая линия), а вариабельные петли (loops, изображены пунктиром) моделируются методами молекулярной динамики Напомним, что при выравнивании аминокислотных последовательностей мы оценивали их «похожесть» с помощью значений, взятых из матрицы замещения. При выравнивании аминокислотной последовательности и профиля (как профиля последовательностей, так и структурного профиля) для оценки использовалась позиционно-специфичная матрица замещения, характеризующая профиль. Из этих примеров очевидно, что обязательным условием поиска оптимального выравнивания двух последовательностей является наличие некоторого критерия, позволяющего оценить, насколько выравниваемые символы из последовательностей «подходят» друг другу. В трединге в качестве такого критерия используют энергетические функции.

Энергетическая функция позволяет оценить, насколько для конкретной аминокислоты подходит каждая из позиций в структуре, с которой производят выравнивание. В общем случае введение энергетической функции требует решения ряда проблем, и основные различия между методами трейдинга заключается в подходе к их решению.

Первая проблема состоит в том, что естественная энергетическая функция не является локальной по отношению к аминокислотной последовательности, в отличие от матриц замещения, в том числе и позиционно-специфичных. Нелокальность функции означает, что результат ее вычисления для пары «остаток — позиция структуры» зависит от того, как расположены в структуре белка другие остатки аминокислотной последовательности. Точное решение этой задачи требует перебора всех или почти всех вариантов выравнивания данной аминокислотной последовательности и структуры, что невозможно осуществить за разумный период времени даже для небольших последовательностей.

Первым и, пожалуй, наиболее очевидным решением данной проблемы была модификация алгоритма выравнивания с введением возможности учета нелокальное™ энергетической функции. Для уменьшения времени, затрачиваемого па поиск оптимального выравнивания, вводились ограничения на наличие пропусков в элементах вторичной структуры (спирали и p-структуры), а также на длину пропусков, что ограничивало количество возможных выравниваний.

Альтернативным решением являлось применение двойного динамического программирования, т. е. отбора оптимальных партнеров взаимодействия для каждой пары «остаток — позиция структуры» на первом этапе выравнивания с последующим использованием только наиболее весомых взаимодействий.

Наконец, третий подход — «замороженная аппроксимация» {frozen approximation) — подразумевал использование для расчета энергетической функции остатков, находившихся в структуре оригинального белка. Часто данный подход применяется в режиме нескольких итераций, т. е. проводится выравнивание с использованием оригинальных остатков, после чего они в структуре заменяются согласно полученному выравниванию, и на основании полученной композиции остатков проводится следующая итерация выравнивания и т. д.

Вторая проблема, которую необходимо решить для проведения трединга, — выбор самой энергетической функции. Поскольку истинный набор сил, которые следует учитывать в расчетах подобного рода, неизвестен, и с учетом того, что расчеты необходимо производить с большой скоростью, авторы методов обычно оперируют эмпирическими потенциалами контактов {knowledge based {empirical) contact potentials). Эти потенциалы могут включать усреднения для «быстрых» степеней свободы системы. Иными словами, те движения атомов и молекул, которые происходят в очень короткие промежутки времени, например колебание вдоль химических связей или движение молекул растворителя, заменяются эмпирическими «усредненными силовыми полями» {mean force potentials).

Третий источник различий в методах трединга — реализация представления боковой цепи аминокислотного остатка и поиск ее оптимальной конформации. Поскольку боковая цепь каждой аминокислоты может принимать несколько различных конформаций, то для точной оценки всех возможных выравниваний, для каждого выравнивания нужно производить перебор всех конформационных состояний каждой аминокислоты последовательности, что еще больше усложняет задачу. Сокращение объема необходимого конформационного поиска производится в основном в двух направлениях:

• 1) первый класс упрощений предлагает объединять атомы в некоторые «группы» (псевдоатомы) с усредненными свойствами, вплоть до редукции боковой цепи до Ср-атома и расчета энергии сразу на уровне аминокислот;
• 2) альтернативой объединению атомов в группы является ускорение конформационного поиска путем элиминации конформаций боковых остатков, которые будут заведомо невыгодны для всех или большинства аминокислот в ближайшем окружении, с помощью так называемых алгоритмов ветвей и границ — branch and boundК

Методы, близкие к ab ш/йо-подходу. Микротрединг, сборка структуры из фрагментов. Карты контактов. По мере развития методов определения укладки молекулы наблюдается явное смещение в сторону так называемого ab /шйо-подхода к предсказанию пространственной структуры, т. е. предсказания, основывающегося исключительно на физико-химических свойствах аминокислотных остатков и свойствах растворителя. Ab initio- предсказание пространственной структуры белков моделирует структуру белка посредством оптимизации некоторой функции свободной энергии системы, которая описывает физические свойства либо статистические предпочтения аминокислот. При этом в литературе ab ш/йо-подход обычно противопоставляется подходу сравнительного моделирования. Здесь следует напомнить, что изначально сравнительное моделирование произошло от гомологичного моделирования (homology modeling), т. е. моделирования структуры белка по уже известной структуре его близкого гомолога.

Однако по мере повышения чувствительности методов поиска похожих последовательностей в базах данных и, соответственно, понижения коэффициента идентичности исследуемой последовательности и последовательности матричной структуры в сравнительном моделировании росла роль методов молекулярной динамики для моделирования укладки боковых цепей остатков, а также моделирования вариабельных петель, т. е. участков низкой гомологии. Методы молекулярной динамики относятся к ab ш/йо-подходу, поскольку пытаются моделировать изменение конформации участка молекулы через серию конформационных переходов, анализируя свободную энергию системы па каждом этапе.

Одним из ярких примеров методов, находящихся на стыке трединга и классического ab initio-подхода, является «сборка» молекулы из корот;

¹ Алгоритмы ветвей и границ представляют комбинаторную задачу в виде дерева решений, при этом ветви, для которых решение заведомо будет неоптимальиым, исключаются из обработки, что позволяет сократить время вычислений.

ких фрагментов уже известных структур {fragment assembly approach), или микротрединг. При микротрединге структура молекулы для исследуемой последовательности собирается из фрагментов длиной примерно 7—10 остатков. При этом сами фрагменты отбираются по сходству аминокислотных последовательностей фрагмента структуры и участка исследуемого белка. Такой отбор позволяет избежать необходимости «подгонять» конформации боковых цепей создаваемой структуры. Оценка каждого варианта собранной структуры производится с помощью энергетических функций, характерных для трединга.

Другим примером нехарактерного для сравнительного моделирования подхода является моделирование карт контактов {contact maps). Карта контактов является квадратной бинарной матрицей размерности N, где N — длина аминокислотной последовательности. Элементы матрицы принимают значение С_{; ;} = 1, если остатки с номерами i и j находятся в контакте, иначе C_itj = 0 (рис. 3.46).

Рис. 3.46. Карта контактов для ингибитора химотрипсина 2 (CI2):

показана лишь половина матрицы, поскольку матрица симметрична относительно главной диагонали. Черные точки обозначают места контактов, обведены и подписаны кластеры контактов: G — 310-спираль; а — альфа-спираль; Т_{ и Т₂ — повороты; Р₂Р₃ ^— параллельный бета-слой; Рф₄ и р₃р₄ — антипараллельные бета-слои Стоит отметить, что в литературе встречаются разные способы определения того, контактирует ли пара остатков. Рассмотрим крайние варианты определения контакта:

• 1) вариант «только Са-атомы». Это минималистичный подход, в котором считается, что остатки находятся в контакте, если расстояние между их Са-атомами меньше определенного значения (8—12 А), при этом обычно указывается некоторое ограничение на минимальное расстояние между остатками по цени (поскольку все остатки, расстояние по цепи между которыми меньше этого значения, по определению оказываются в контакте);
• 2) вариант «все атомы». В данном подходе, как очевидно из названия, для определения наличия контакта между остатками полипептидной цепи анализируются расстояния между всеми атомами боковых цепей данной пары и сравниваются с некоторыми «отсекающими» значениями, которые могут быть разными для атомов разных типов.

Все остальные встречаемые в литературе определения контактов являются различного рода компромиссами на базе этих подходов и в этом похожи на способы представления боковых цепей аминокислот в грединге.

Представление пространственной структуры полипептидной цепи в виде карты контактов несет несколько преимуществ:

• • это представление инвариантно относительно координат остатков, т. е. вне зависимости от того, как «повернут» или смещен белок в трехмерном пространстве, ему соответствует одна и та же карта контактов;
• • моделирование объекта, представленного двумерной матрицей, в большинстве случаев проще, чем объекта, описываемого массивом координат;
• • по картам контактов возможно восстановление исходных пространственных структур, при этом корректное восстановление возможно даже в случае «зашумленных» карт контактов.

Таким образом, карты контактов предоставляют возможность для создания алгоритмов предсказания пространственной структуры белка на основе предсказания карт контактов аминокислотных остатков. Существуют еще методы выравнивания карт контактов, так что предсказание карт контактов также может быть использовано при поиске матричной структуры для сравнительного моделирования.