Количественный анализ хромофиллов

Количественный анализ хромофиллов в применении к физиологическим задачам (стр. 57 и 70) не может прибегать к весовому определению естественных пигментов или их производных, и это по двум причинам: отсутствию соответственных методов отделения веществ в достаточном количестве и необходимости ограничиваться исследованием небольших количеств пигментов. Надлежащий метод, следовательно, титриметрический.

Напрашивается мысль, нельзя ли хроматографический или хроматоскопический метод превратить в хроматометрический, выражая количество компонентов смеси высотой обусловливаемых ими адсорбционных зон, т. е., так сказать, определяя их в «адсорбционных эквивалентах*. Опыты, произведенные мною в этом направлении, не дали удовлетворительных результатов, да и теоретическое рассуждение показывает, что предполагаемой пропорциональности между количеством определенного пигмента и высотой занимаемого им столба адсорбента не существует. Коэффициенты адсорбции, как мы видели (стр. 80), зависят от концентрации раствора и не просто пропорциональны ей. Кроме того, могут интерферировать бесцветные вещества, изменяя коэффициенты адсорбции (стр. 135). Таким образом, измерение относительной или абсолютной высоты адсорбционных зон может дать только грубое понятие об относительном количестве присутствующих веществ. Остается, следовательно, спектроколориметрический или спектрофотометрический метод. Об условиях и точности спектрофотометрических измерений будет речь в главе XI, здесь же рассмотрим условия количественного извлечения пигментов из тканей и отделения их друг от друга. Последнее должно происходить на основании адсорбционного анализа.

Полное извлечение спирторастворимых пигментов из тканей легко произвести метиловым или этиловым алкоголем, но из этих растворов перевести пигменты сполна в пригодные для адсорбции растворители трудно. При взбалтывании постепенно разбавляемого водою спиртового экстракта с сероуглеродом или петролейным эфиром часть пигмента выпадает коллоидально в водноспиртовой фазе и образует трудно разрешающуюся эмульсию. Метод же выпаривания спирта и растворения остатка в надлежащей жидкости негоден, ввиду того, что раствор обязательно содержит воду; во время дестилляции относительная концентрация этой воды все возрастает, и действие на пигменты содержащихся в растворе электролитов усиливается, чему содействует повышенная температура. Полного извлечения тканей бензолом, сероуглеродом или петролейным эфиром с примесью спирта трудно или даже невозможно добиться (стр. 112). Самым рациональным приемом поэтому является следующий. Тщательно растертая с наждаком или толченым стеклом ткань обрабатывается (при дальнейшем растирании в ступке) эфиром или смесью эфира со спиртом, с заменою растворителя до тех пор, пока он не перестанет окрашиваться. Эфирный экстракт взбалтывается два-три раза в разделительной воронке с водою, для удаления из него электролитов (солей, кислот) и спирта, и обезвоживается безводным Na₂S0₄. После этого эфир легко отгоняется в вакууме, и остаток, растворенный в сероуглероде, бензоле или петролейном эфире, подвергается хроматографическому разложению.

Задача количественного анализа требует полного обособления зон в хроматограмме так, чтобы каждая зона была вполне однородна и не налегала на соседнюю. Такому обособлению зон содействует, как мы видели, миграция их под влиянием тока подходящего растворителя. Тем не менее, может случиться, что благодаря неровности поверхностиразделяющей две остающиеся смежными зоны, механическое их разделение ножом не вполне точно удается. Подобный случай встречается в анализе хлорофилла при разделении зон хлорофиллинов аир. Затруднение это можно обойти, подвергая спектроколориметрическому определению не хлорофиллины, а их ближайшие кислотные производные, хлорофилланы, а и р, в которые они превращаются при предварительной обработке ткани щавелевой кислотой (см. II часть). В хроматограмме измененного таким образом хлорофилла (из петролейно-эфирного раствора) зоны хлорофилланов являются не смежными, а разделенными зоной ксантофилла (стр. 126). При механическом отделении хлорофиллановых зон примесь ксантофилла в них не будет иметь значения, так как спектрофотометрическое определение хлорофилланов можно (и удобнее) произвести в красных лучах, ксантофиллами заметно не поглощаемых.

Тесно соприкасаются тоже в хроматограммах хлорофилла зоны ксантофилла р и хлорофиллина р. Для титрации первого можно поступить следующим образом. Обе зоны вырезываются вместе и извлекаются алкоголем; обрабатывая раствор едким кали, мы превращаем хлорофиллин в нерастворимый в эфире дериват и, следовательно, можем легко отделить ксантофилл, переводя последний в эфир.

Наиболее легко количественное определение каротина на основании приема дробной адсорбции (стр. 135) в том случае, когда он является единственным неадсорбируемым компонентом смеси, что, конечно, должно быть всегда проверено.