Определение «сырого» протеина (по методу Кьельдаля)

Все азотсодержащие вещества корма получили название «сырого» протеина (кроме азота белков и продуктов его распада улавливается азот амидов, азотсодержащих глюкозидов, нитратов, нитритов и других азотсодержащих соединений).

Определение сырого протеина производят по Къельдалю макроили микрометодом.

Метод основан на определении азота, а по нему сырого протеина, путем сжигания навески корма в концентрированной серной кислоте. Образующийся при этом аммиак переходит в аммонийную соль серной кислоты. В дальнейшем эта соль разлагается щелочью и в процессе отгонки выделяющийся аммиак улавливается титрованным раствором серной кислоты. Реакции протекают по следующим уравнениям: Сжигание:

NH₂CH₂COOH + 3H₂SO₄ > NH₃ +2СО₂ + 4Н₂О +3SO₂

2NH₃ + Н₂SO₄ > (NH₄)₂SO₄

Отгонка:

• (NH₄)₂SO₄ + 2NaOH > 2NH₄OH + Na₂SO₄
• 2NH₄OH > 2NH₃ + 2H₂ O
• 2NH₃ + H₂SO₄ > (NH₄)₂SO₄

Ход определения. В пробирку помещают около 1 г исследуемого корма (при микрометоде 0,1−0,3 г), взвешивают на аналитических весах и переносят навеску на дно колбы Къельдаля. Для этого на пробирку с кормом надевают небольшой резиновый шланг, подводят ее ко дну опрокинутой колбы и, переворачивая, высыпают содержимое в колбу. Пустую пробирку взвешивают на тех же весах и по разности между массой пробирки с кормом и пустой находят массу навески.

В колбу Къельдаля к навеске корма осторожно приливают 20 мл (при микрометоде 5 мл) концентрированной серной кислоты (из автомата), содержимое аккуратно перемешивают и ставят в наклонном положении на колбонагреватель в вытяжном шкафу. Содержимое колбы доводят до кипения (в начале осторожно, не давая вспениться). При сжигании в колбы периодически добавляют по 3−5 мл перекиси водорода. Перед вливанием катализатора их несколько охлаждают. Сжигают корм до получения светлого раствора.

После осветления жидкость охлаждают, осторожно добавляют небольшое количество дистиллированной воды (100−150 мл) и переливают без потерь в колбу для отгонки на 600−800 мл. Колбу Къельдаля несколько раз промывают дистиллированной водой. Общее количество жидкости в колбе для отгонки не должно превышать половины ее объема. Одновременно в приемную коническую колбу наливают 50 мл 0,1 н раствора серной кислоты, 2−3 капли индикатора метилоранжа и ставят в аппарат Къельдаля, опустив конец стеклянной трубки холодильника в кислоту.

В колбу для отгонки бросают немного пемзы или несколько кусочков цинка для равномерного кипения, приливают осторожно по стенке 80 мл 33%-ного раствора едкого натра (примерно в 4 раза больше, чем взято кислоты для сжигания навески, 30%-ного — 88 мл, 40%-ного — 66 мл), колбу тотчас же закрывают пробкой с каплеуловителем от аппарата, перемешивают и ставят на колбонагреватель.

При нагревании выделяющийся аммиак связывается с 0,1 н раствором серной кислоты. Ведут отгонку аммиака до тех пор, пока капля перегона не перестанет окрашиваться в синий цвет красную лакмусовую бумагу. При хорошем кипении отгон длится 30−40 мин.

После окончания отгонки конец стеклянной трубки холодильника обмывают небольшим количеством дистиллированной воды, собирая ее в приемную колбу. Затем содержимое приемной колбы титруют 0,1 н раствором едкого натра по индикатору метилоранж, определяя избыток серной кислоты. По разности, взятой в приемную колбу серной кислоты (50 мл) и оттитрованной свободной, устанавливают кислоту, связанную с аммиаком.

При расчете содержания азота в навеске учитывают, что 1 мл 0,1 н раствора серной кислоты эквивалентен 0,0014 г азота.

Процентное содержание азота в воздушно-сухом веществе корма вычисляют по формуле 1.

Количество сырого протеина рассчитывают умножением показателей содержания азота на соответствующие коэффициенты, представленные в таблице.

Коэффициенты для пересчета азота.

Коэффициенты определены с учетом содержания азота в протеине, которые по кормам колеблются от 13 до 19%.

Данные по определению «сырого» протеина заносят в таблицу 4.

Таблица 4 — Определение «сырого» протеина в корме.