Цианогенные гликозиды и глюкозинолаты

Цианогенные гликозиды и глюкозинолаты также являются азотсодержащими веществами (рис. 6.22). Их иногда называют прототоксинами или фитоантисипинами. Они принимают непосредственное участие в защите растений от травоядных животных. При гидролизе цианогенных гликозидов специфичной гликозидазой выделяется синильная кислота.

Цианогенные гликозиды широко распространены в растительном царстве и часто встречаются у представителей бобовых, розоцветных и некоторых злаков. Их много также в крахмалистых клубнях маниока Manihot esculenta. Это важный пищевой продукт в ряде тропических стран. Клубни и мука маниока — обычная пища для аборигенов, которые научились в процессе приготовления избавляться от токсичных соединений.

Рис. 6.22. Цианогенные гликозиды высших растений.

Вторая важная группа растительных прототоксинов — глюкозинолаты — впервые была выявлена у растений семейства крестоцветных Cruciferae. В растении глюкозинолаты, так же как и цианогенные гликозиды, пространственно отделены от гидролизующих их ферментов. При повреждении растительных тканей происходит смешивание глюкозинолатов с соответствующими ферментами и превращение их в летучие токсичные вещества с горчичным запахом — изотиоцианаты и нитрилы. Образующиеся вещества функционируют как токсины и репелленты для травоядных животных. Большинство исследований, посвященных глюкозинолатам, выполнено на рапсе Brassica парт, который служит важным источником для получения пищевого растительного масла в Северной Америке и Европе. Одна из основных задач селекционеров состоит в получении семян рапса с резко сниженным содержанием глюкозинолатов.

Таким образом, в растениях синтезируются различные соединения вторичного метаболизма. Их группы находятся в растении в динамическом состоянии, а содержание меняется от органа к органу в ходе онтогенеза. Поэтому, с одной стороны, при проведении скрининга желательно собрать как можно больше образцов разных частей растений на разных фазах развития, а с другой — при интерпретации полученных данных необходимо сравнивать данные о содержании изучаемого соединения в сходных частях растений, отобранных на одной и той же фазе развития. Очевидно, что данные о динамике содержания вторичных метаболитов представляют непосредственный интерес при проведении хемотаксономических исследований.

Поскольку многие из вторичных метаболитов обладают высокой биологической активностью, они находят широкое практическое применение. И в этом плане перспективным источником их получения могут быть каллусные и суспензионные культуры высших растений.

Культуры in vitro — продуценты вторичных соединений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей в условиях in vitro позволяют использовать их для практического применения. Особый интерес представляет способность изолированных клеток, тканей и органов синтезировать вещества вторичного метаболизма, которые широко применяют в медицине, ветеринарии, кормопроизводстве, пищевой промышленности, парфюмерии, для защиты растений и др.

Интерес исследователей к этому направлению работ не случаен. По сравнению с использованием традиционного растительного сырья, получение физиологически активных веществ методами клеточной биотехнологии имеет ряд преимуществ, так как:

• — процесс получения биомассы клеток автоматизирован и не зависит от сезона, климатических и почвенных условий;
• — можно оптимизировать условия культивирования суспензии клеток, позволяющих синтезировать в необходимом количестве нужные вещества.

Использование клеточных культур растений для получения вторичных метаболитов важно и в тех случаях, когда:

• — невозможно выращивание растения в природе;
• — имеются трудности в его сборе;
• — содержание вторичных соединений в культурах in vitro высокое или высока его цена на мировом рынке;
• — возможен хороший рост клеточных культур растений на сравнительно простых по составу питательных средах;
• — вторичное соединение (соединения) выделяется клетками в питательную среду;
• — можно получить высокопродуктивные растительные культуры.

Основным условием культивирования изолированных клеток и тканей в условиях in vitro является тот факт, что они, так же как и интактные растения, синтезируют вторичные метаболиты.

Первые данные, касающиеся синтеза вторичных соединений в клеточных культурах растений, появились в литературе в 1940 г., когда Дж. Боннер сообщил об образовании каучука клетками гваюлы. Первыми лекарственными растениями, исследованными в культуре ткани, были барвинок розовый и белена черная. Исследования В. Телле и Ф. Готре доказали способность культуры ткани белены к синтезу алкалоидов. Позднее появились и другие сообщения о получении культур тканей различных лекарственных растений, способных синтезировать многие уникальные соединения вторичного метаболизма. Это культуры ткани табака, накапливающие большие количества никотина (0,7%), диоскореи — диосгенина (1,6%) и др.

В отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН собрана большая коллекция используемых в промышленности клеточных культур растений, синтезирующих вторичные метаболиты. Это культуры женьшеня дальневосточного (источник алкалоида диосгенина), диоскореи дельтовидной (источник стероидных гликозидов), раувольфии змеиной (продуцент антиаритмического алкалоида аймалина), стевии (источник заменителя сахара — стевиозида) и др. В последние годы большое внимание в мире уделяется культивированию клеток тиса ягодного, синтезирующего уникальное вещество терпеноидной природы — таксол, который является противораковым препаратом.

Использование культур in vitro для получения вторичных соединений связано с их высокой продуктивностью. Экспериментально доказано, что прирост клеточной биомассы в условиях in vitro и in vivo проходит с разной скоростью. Например, за год прирост корня женьшеня в тайге составляет 1 г, на плантации — 3 г, а при выращивании клеток корневого происхождения на агаре (in vitro) можно получать 0,4 г сухой массы на литр среды в день. Биомасса клеток женьшеня в суспензии при выращивании в 50-литровом ферментере увеличивается до 2 г в литре среды за сутки, что в тысячу раз больше, чем при выращивании на плантации. Учитывая высокую стоимость женьшеня (килограмм плантационного корня стоит 100—150 долларов), цена дикорастущего корня может доходить до нескольких тысяч долларов. Поэтому с экономической точки зрения биотехнологический способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма перспективен.

Вещества вторичного синтеза, как правило, получают из суспензионной культуры, которую выращивают в биореакторах или ферментерах. Важной характеристикой клеток популяции является ее стабильность в отношении синтеза метаболитов. Она может сохраняться в течение всего времени существования популяции, постепенно снижаться за счет медленного увеличения числа клеток с низким синтезом метаболитов или быть нестабильной в случае быстрой потери способности клеток синтезировать вторичные метаболиты.

Технология выращивания культур клеток в биореакторах представляет собой масштабный процесс. Специалисты немецкой фирмы DIVERSA (ныне — FYTON) осуществили выращивание ряда культур в биореакторах объемом до 75 тыс. л. В России на Омутнинском биохимическом заводе в биореакторах объемом до 2,5 м³ в промышленном масштабе получили биомассу женьшеня. В ТОО «Тэмбр» (г. Ярославль) осуществлено проточное культивирование клеток женьшеня в промышленных биореакторах объемом 7,5 м³. В Институте физиологии растений РАН оптимизированы режимы культивирования целого ряда различных культур клеток высших растений (женьшеня настоящего, полисциаса и других аралиевых, диоскореи дельтовидной, маральего корня и др.) в биореакторах объемом 630 л.

Российские ученые разработали технологию, жизненно важную для десятков тысяч пациентов. Она позволяет получать практически любое требуемое количество паклитаксела — основы одного из самых эффективных, но и самых дорогих препаратов для лечения некоторых видов онкологических заболеваний, в том числе рака легкого, яичников и молочной железы. Субстанция, полученная по новой технологии, по структуре ничем не отличается от обычной, но стоить будет, по мнению авторов, существенно дешевле. Дело в том, что высокая цена паклитаксела — это не прихоть фармацевтов, а следствие огромных затрат на его производство. В природе он есть только в коре очень редкого и очень медленно растущего дерева — тихоокеанского тиса. Чтобы выделить количество, необходимое для лечения только одного пациента, нужно собрать кору с 10—12 взрослых деревьев. Понятно, что такое лекарство дешевым просто не может быть. Разумеется, что, обнаружив удивительные свойства паклитаксела, ученые искали способы более дешевого его получения. Были разработаны и методы химического синтеза, и способ получения полупродукта из хвои тиса с последующей его переработкой в паклитаксел. Но оказалось, что синтетический аналог существенно дороже вещества, выделенного из природного сырья.

Метод же, который предлагают использовать специалисты ОАО «Биохиммаш», относится к области биотехнологии. Это ценное лекарство ученые научились выделять из природного сырья. Но не из деревьев, а из культуры клеток тиса, выращенных в ферментере и способных эффективнее прочих вырабатывать искомую субстанцию.

Продуктивность клеточных культур высших растений в отношении синтеза вторичных веществ зависит также от состава питательной среды, используемой для их выращивания.

Обязательными компонентами питательных сред являются углеводы. Клеточные культуры могут расти на различных углеводах (испытано более 30 различных соединений), но в большинстве случаев их лучший рост отмечается при добавлении в питательную среду двух сахаров — глюкозы или сахарозы. В то же время высокий уровень синтеза свойствен культурам, растущим на сахарозе, а на питательных средах с глюкозой синтез часто сильно ослаблен. Причины этого явления пока не ясны. Повышенные концентрации сахарозы (5%) в среде эффективны для роста культуры диоскореи, а пониженные (1,5%) — для продуктивности диосгенина.

Минеральный состав питательных сред также оказывает большое влияние на синтез вторичных соединений; при этом наиболее важно содержание фосфора, калия и различных форм азота. Высокие концентрации фосфора в большинстве случаев приводят к улучшению роста культуры и ослаблению синтеза вторичных метаболитов. Это отмечено для синтеза никотина в культуре клеток табака, антоцианов — в культивируемых клетках моркови, катехинов — в каллусах чая. Накопление вторичных веществ в культурах in vitro обычно начинается после исчерпания фосфора из среды.

Имеются данные о том, что повышение концентрации фосфора в питательной среде увеличивало содержание алкалоидов в культуре барвинка розового и антрахинонов в культуре клеток Galium sp.

Показано, что как для роста, так и для синтеза вторичных соединений необходимы минеральные формы азота. При этом органические формы (пептон, дрожжевой экстракт и др.) тормозят и рост, и синтез.

Очень важно соотношение аммонийного и нитратного азота. Можно проследить определенную тенденцию: повышение доли нитратного азота способствует увеличению синтеза вторичных веществ, в частности диосгенина, в культуре клеток диоскореи.

Фитогормоны как компоненты питательных сред привлекают наибольшее внимание исследователей. Однако влияние гормонов на синтез вторичных соединений в культуре клеток неоднозначно и может меняться, в зависимости от класса вторичных соединений, физиологического состояния культуры, условий культивирования и др.

Наиболее интенсивно изучались ауксины и цитокинины, поскольку они являются необходимыми компонентами питательных сред. Имеется множество примеров, когда ауксины стимулировали или подавляли синтез вторичных соединений. Ауксины стимулировали синтез антоцианов в культурах моркови и тополя, антрахинонов — в Cassia fistula и Cassia torra, сапогенинов — в тригонелле; уменьшали и исключали синтез антрахинонов и шиконина в воробейнике, скополамина — в гиосциамусе, хлорогеновой кислоты — в табаке.

Достаточно часто влияние ауксинов на синтез вторичных метаболитов зависит от их природы. Так, синтез никотина в табаке стимулируется НУК и ИУК, но тормозится 2,4-Д; синтез антоцианов и нафтахинонов в клетках культуры Plumbago zeylanica, наоборот, стимулируется повышенными концентрациями 2,4-Д и тормозится ИУК и НУК. В целом 2,4-Д чаще, чем ИУК и НУК, отрицательно влияет на синтез вторичных соединений.

Результатов по влиянию цитокининов на синтез вторичных соединений существенно меньше, что не позволяет выявить какие-либо закономерности. Например, бензиламинопурин стимулировал синтез стероидных сапогенинов в культуре паслена, а кинетин также стимулировал синтез алкалоидов в клетках скополии, но полностью ингибировал синтез никотина в культуре клеток табака.

Результаты по другим классам фитогормонов весьма фрагментарны и противоречивы.

Изучению влияния предшественников синтеза вторичных метаболитов на продуктивность клеточных культур посвящено значительное число работ. В большинстве случаев добавление их к питательной среде не приводило к существенному увеличению продуктивности клеток. По всей видимости, концентрация предшественников не является определяющим фактором для синтеза вторичных соединений в культуре.

Все это свидетельствует о том, что, используя различные комбинации питательных сред, можно повысить продуктивность клеточных культур высших растений и эффективность синтеза вторичных веществ.