Оценка суммарного генотоксического воздействия загрязнения атмосферного воздуха и поверхностных вод методом микроядерного тестирования

Оценка суммарного генотоксического воздействия загрязнения атмосферного воздуха и поверхностных вод методом микроядерного тестирования Козак М. Ф.,.

Щепетова Е.В.,.

Марченко Н.В.

Антропогенная нагрузка на экосистемы Нижней Волги и других территорий достигла столь высокого уровня, что проблема оценки состояния атмосферного воздуха и воды стала одной из центральных среди всех экологических проблем. Загрязнение атмосферного воздуха и воды урбанизированных территорий связано с введением токсичных (и мутагенных) химических веществ, в более широком смысле — загрязняющих веществ (ЗВ). Воздух и природные воды содержат огромное разнообразие химических компонентов, проявляющих друг к другу ингибирующее, аддитивное, синергическое, сенсибилизирующее воздействие, биологический эффект суммарного действия которых невозможно оценить путем идентификации отдельных компонентов. Мониторинг присутствия каждого химического ЗВ технически нереален. В этих условиях разработка, экспериментальное сравнение и применение наиболее перспективных способов и методов пространственно-временной оценки суммарного генотоксического воздействия загрязнения воды, воздуха и почвы в процессе урбанизации и промышленного использования дельтовых территорий, как основы создания технологии и тестов экспресс-анализа, приобретает особую актуальность. Это обусловлено катастрофическим изменением почвенного и растительного покрова дельты Волги и необходимостью оценки и прогнозированием возможных экстремальных ситуаций в экосистемах в условиях возрастания антропогенного давления на биоценозы.

Многие ЗВ, находящиеся в атмосферном воздухе, воде, почве обладают мутагенными свойствами (генотоксиканты) и вызывают образование микроядер в клетках некоторых тканей и органов растений и животных. Метод микроядерного тестирования исследовался и использовался нами для оценки уровня генотоксического воздействия суммарного загрязнения атмосферного воздуха (1995;2006 г. г) города Астрахани и Астраханской области. В качестве показателя загрязнения воздуха генотоксикантами использовалась частота встречаемости клеток с микроядрами (МЯ) в апикальной меристеме почек тополя черного (Populus nigra L.). Тополь черный используется в качестве индикатора для осуществления мониторинга состояния загрязнения воздуха, так как это растение повсеместно присутствует в озеленении городов [4,5]. Генотоксические компоненты загрязнения атмосферного воздуха индуцируют в клетках меристемы конуса нарастания почек тополя различные типы хромосомных аберраций, а также геномные нарушения, которые в конечном итоге приводят к образованию МЯ. Частота возникновения МЯ зависит от степени загрязненности воздуха генотоксикантами. В качестве контроля использовали меристему почек деревьев тополя чёрного, произрастающих на заповедных территориях и в Астраханском Кремле. Территория Кремля характеризуется как наиболее высокая точка города, хорошо аэрируемая зона. В начальный период исследований (1995;1996 годы) территория, непосредственно примыкающая к Кремлю (площадь Ленина), была свободна от автотранспорта, и наименее загрязнена выхлопными газами автомобилей. Доля клеток с МЯ в меристеме почек тестовых деревьев территории Кремля была минимальной (от 0 до 2%). В 1997 году по площади Ленина прошла автомагистраль. Уровень МЯ в клетках меристемы почек тополя резко повысился до 7% (1998 г.) В дальнейшем частота возникновения МЯ в клетках меристемы почек тополя на территории Кремля постепенно снизилась до 3−5%. Исследование динамики частоты встречаемости клеток с МЯ тестовых объектов было продолжено на этой и других территориях города и области.

антропогенный атмосфера загрязняющий.

Рис. 1 Образование микроядер в клетках апикальной меристемы почек тополя (Populus nigra L.)

1.1. метафазная пластинка помимо основного ядра в клетке; 1.2 многоядерная клетка; 1.3 — 1.7 процесс образования многоядерной клетки; 1.8 МЯ небольшого размера рядом с основным ядром клетки; 1.9 два почти не отличающихся по размерам ядра в клетке Материал и методика. Почки (без верхних чешуй) репрезентативно собирали в нижнем ярусе дерева, фиксировали ацетоалкоголем осенью и весной. Непосредственно перед окрашиванием ацетокармином материал протравливали в водном растворе железоаммиачных квасцов. Цитологическому анализу в каждый точке отбора проб подвергалось от 1000 до 5000 клеток меристемы. На препаратах учитывали долю клеток с МЯ отношением к общему числу исследуемых клеток меристемы. Оценку достоверности доли и разности долей проводили с помощью метода альтернативного анализа и критерия Стьюдента.

Экспериментальная часть и обсуждение результатов. В начале обследования различных территорий весной нами было выявлено три типа микроядер, которые отмечались также и другими авторами на других объектах [6]:

МЯ «стандартного» типа (рис 1.8) небольшого размера, хорошо оформлены и находятся близко от основного ядра или на некотором удалении от него, иногда на периферии клетки.

МЯ «основного» типа (рис. 1.9) не отличаются размерами от основного ядра, возникая очень близко от него.

В некоторых случаях вместе с основным ядром встречается «неоформленный хромосомный материал» (рис. 1.1).

В процессе дальнейших исследований наибольшую вероятность встречаемости имели клетки с МЯ «основного» типа, что свидетельствовало о наличии нарушений функционирования митотического веретена деления (Ильинских, 1982) в ответ на действие постоянного загрязненного фона воздушной среды. По данным различных авторов [1,2,7 и другие] присутствие МЯ «основного» типа свидетельствуют о наличии в атмосферном воздухе загрязнителей, обладающих статмокинетическим действием. Меньшее количество клеток с МЯ «стандартного» типа и клеток с расположением хромосом на стадии метафазы, помимо основного ядра, свидетельствует о возрастании частоты возникновения структурных нарушений хромосом, в результате появления дополнительных источников загрязнения.

В дальнейшем при цитологическом анализе нами были обнаружены клетки, с количеством МЯ от 2 до10 (рис. 1.2), а также различные стадии образования многоядерных клеток (рис. 1.3 — 1.7), что отмечается также другими авторами у других объектов [3, 14] как «задержанный полиплоидизирующий митоз» при отсутствии цитотомии. Хромосомы (или группы их) оттесняются цитоплазмой и образуют добавочные МЯ. Это явление объясняется тем, что внешние факторы тормозят перемещение элементов фрагмопласта в экваториальную область и задерживают их слияние в межклеточную пластинку. Для обозначения процессов, происходящих при образовании клеток в таких случаях, некоторые авторы используют понятие «гипополиплоидный рост» [16]. Развитие клеточной популяции совершается при непрерывно продолжающихся и следующих один за другим ряде K-митозов [15] без цитотомии. Проведённые нами исследования на территориях с различной антропогенной нагрузкой [10,11 и другие] позволили установить, что максимальная доля клеток с микроядрами в меристеме почек тополя чёрного наблюдается при фиксации почек весной. В результате специфического «задержанного» характера митоза", происходящего ещё осенью в период листопада, в апексах почек тополя и последующего длительного периода в течение всего зимнего периода происходит накопление случаев патологии митоза. Индикатором увеличения загрязнения воздуха является закономерное увеличение доли клеток апикальной меристемы почек, имеющих МЯ, за период от осени к весне и возрастание степени многоядерности клеток. На территориях с высокой антропогенной нагрузкой, вблизи автотрасс, на территориях, подверженных воздействию воздушных выбросов промышленных предприятий (санитарно-защитная зона действия Астраханского газового комплекса), выявляется максимальное количество разнообразных типов нарушений процесса «задержанного митоза» без цитотомии, определяющих возникновение микроядер. Микроядерный тест оказался высокочувствительным, доступным и объективным показателем генотоксического влияния ЗВ атмосферного воздуха различных территорий. Он может быть использован в скрининге и мониторинге мутагенов атмосферного воздуха для целей экспрессанализа.

Рис. 2.Образование микроядер в клетках апикальной меристемы зародышевых корней A. cepa L.

Библиографический список.

• 1. Алов И. А. К вопросу о соотношении между митозом и амитозом, // Известия А.НСССР. Серия биол. 1958. № 4. С. 403 — 407.
• 2. Алов И. А. Цитофизиология и патология митоза: 1972. М. 209 с.
• 3. Бродский В. Я. Урываева ИВ. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка.1987. М.: Наука. 260 с.
• 4. Гуськов Е. П., Шкурат Т. П., Вардуни Т. В. Тополь, как объект мониторинга мутагенов в окружающей среде. //Цитология и генетика. 1976. Т. 24. С. 52−57.
• 5. Гуськов Е. П., Вардуни Т. В., Шкурат Т. П., Милютина Н. П., Мирзоян А. В. Свободно радикальные процессы и уровень аберраций хромосом в листьях древесных растений как тест-системы на генотоксичность городской среды // Экология, № 4, — 2000 — С. 270−275.
• 6. Дубинин Н. И, Жулёва Л. Ю. Использование микроядерного теста для оценки экологической обстановки в районах Астраханской области. // Генетика. 1994.Т.30.№ 7. С. 999−1004.
• 7. Дубинин Н. П., Пашин Ю. В. Мутагенез и окружающая среда. М.: Наука. 1978, 128 с.
• 8. Ильинских Н. Н., Ильинских И. И., Некрасов В. Н. Использование микроядерного теста в скрининге и мониторинге мутагенов // Цитология и генетика. 1988. Т. 22. № 7. С. 67−72.
• 9. Ильинских Н. Н. и др. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. 1992.52с.
• 10. Козак М. Ф. Исследование состояния воздушной среды различных районов г. Астрахани с помощью микроядерного тестирования. Естественные науки. //Журн. Фундаментальных и прикладных исследований. Изд-во Астраханского гос. ун-та, 2002 г. № 4 С. 13−20.
• 11. Козак М. Ф., Щепетова Е. В), Марченко Н. В. Эколого-генетическая оценка состояния атмосферного воздуха с помощью микроядерного тестирования // Южно-Российский вестник геологии, геоморфологии и глобальной экологии. Астрахань. № 1 (14). 2006. С.48−52.
• 12. Материалы к государственному докладу о состоянии окружающей природной среды РФ по Астраханской области // Главное управление природных ресурсов и охраны окружающей среды МПР России по Астраханской области. 2003 г и др.
• 13. Михайлов Г. М., Вознесенская Л. М. и др. Источники выбросов химических загрязнителей г. Астрахани и Астраханской области, анализ условий переноса и влияния на здоровье населения" Астрахань: Издательство ООО «ЦНТЭП», 2002, — 120с.
• 14. Магешвари П. Эмбриология покрытосеменных. Перевод с англ. Транковского Д. А. Под редакцией К. И Мейера. Издательство: И.*Л. М.: 1954. 440 с.
• 15. Ригер Р., Михаэлис А. Генетический и цитогенетический словарь. Перевод с нем. М: «Колос». 1967. 607 с.
• 16. Сидоров Б. Н. Соколов Н.Н. Вакуленко Н. А. Огородникова А.Р. Блокада веретена и гипополиплоидный рост при колхициновом митозе // Полиплоидия и селекция. М.Л.:Наука 1965. С. 109−122.
• 17. Rank J., Nielsen M. N. Evaluation of ana-telofase test to genotoxicity screening of industrial waste water // Mutation research. Fundamental and molecular mechanism of mutagenesis. 1994. V. 312. № 1. P. 17−22.
• 18. Sharma C. B. Plant meristem as monitors of genetic toxity of environmental chemicals // Current science. 1983. V. 52. № 21. P. 1000−1002.