Позитивная и негативная регуляция

— Негативная регуляция инициации транскрипции, или репрессия, осуществляется белками-репрессорами, которые связываются с операторами. Поскольку последовательности оператора и промотора часто перекрываются, связывание репрессоров со своими операторами ограничивает доступ РНК-полимеразы к промотору, подавляя тем самым инициацию транскрипции.

Позитивная регуляция может осуществляться путем связывания специфических белков с нуклеотидными последовательностями, расположенными в области промотора. Считается, что связанный активаторный белок способствует ассоциации РНК-полимеразы с промотором и, следовательно, увеличивает вероятность инициации транскрипции.

а) Регуляция экспрессии галактозного оперона Три гена, кодирующие ферменты, ответственные за метаболизм галактозы у E. coli, организованы в оперон с промотором (Р) и примыкающим к нему регуляторным сегментом-оператором (О) на 5'-конце транскрибируемой последовательности: galE-galT-galK. (прозрачка 4).

Гены, кодирующие регуляторные белки, которые связываются с операторными или активаторными последовательностями, могут находиться как вблизи контролируемых ими генов, так и далеко от них. Например, ген, кодирующий репрессор галактозного оперона (gaIR), не сцеплен с транскрипционной единицей, состоящей из генов galE, gal Т и gal К (прозрачка 4).

б) Регуляция экспрессии арабинозного оперона Синтез ферментов, необходимых для утилизации арабинозы, регулируется двумя сопряженными транскрипционными единицами (прозрачка 4а). Первая — это araоперон, состоящий из трех генов, ara В, ara, А и ara D, и некоего 5'-контролирующего участка. Вторая представлена геном ara С, кодирующим регуляторный белок, необходимый для транскрипции araоперона.

Позитивная или негативная регуляция транскрипции арабинозного оперона зависит от того, образуется или нет комплекс между арабинозой и белком, кодируемым только сцепленным с опероном геном araC (прозрачка 4а) J.

в) Регуляция экспрессии лактозното оперона Рассмотрим позитивную и негативную регуляцию лактозного оперона.

— Негативная регуляция лактозного оперона. Бактерии Е. coli могут использовать в качестве единственного источника углерода и энергии лактозу, поскольку они способны образовывать в большом количестве в-галактозидазуфермент, расщепляющий лактозу на глюкозу и галактозу. Однако при росте на других источниках углерода в клетках E. coli образуется очень мало вгалактозидазы. Ген, ответственный за синтез вгалактозидазы (lac Z), называется индуцибельным, поскольку кодируемый им фермент синтезируется только тогда, когда в клетке присутствуют сахара, имеющие вгалактозильные остатки. Помимо вгалактозидазы, вгалактозиды индуцируют образование еще двух белков: (вгалактозидпермеазы (кодируемой геном lacY), необходимой для проникновения в-галактозидов в клетку, и вгалактозидтрансацетилазы (lac А), фермента с невыясненной пока функцией (прозрачка 5). В этих трех генахlac Z, lacY и lac Асодержится вся информация о белках, кодируемых lac-опероном. Они транскрибируются в единую полицистронную РНК, при трансляции которой образуются почти одинаковые количества соответствующих белков. Поэтому можно сказать, что три гена lас-оперона экспрессируются согласованно.

Со структурными генами lac-оперона связаны несколько типов регуляторных элементов, ответственных за индуцибельность и координированную регуляцию этих генов (прозрачка 5). Промотор — это нуклеотидная последовательность, с которой связывается РНК-полимераза и начинается транскрипция трех структурных генов. Оператор — это сайт, с которым связывается lac-репрессор, подавляющий транскрипцию lас-оперона. Ген 1асI, не входящий в состав lас-оперона, кодирует репрессор — полипептидную цепь с мол. массой 37 000 Да. Репрессор прочно связывается с оператором, находясь в тетрамерной форме.

Поскольку промоторная и операторная последовательности перекрываются, связывание репрессора с оператором мешает связыванию РНК-полимеразы с промотором, что приводит к блокированию транскрипции структурных генов. Транскрипцию оперона можно индуцировать, если блокировать связывание репрессора с оператором (прозрачка 6). Такое блокирование происходит при связывании одного из вгалактозидов с той или иной субъединицей репрессора, что уменьшает сродство последнего к оператору. После отсоединения репрессора от промотра полимераза может связаться с промотором и инициировать транскрипцию оперона.

Очень важно сохранение нуклеотидной последовательности домена lас-оператора, связывающего репрессор. Об этом свидетельствуют результаты исследования эффективности репрессии in vivo у мутантов с модифицированными репрессорами или операторами (прозрачка 7). Интересные данные были получены и при изучении связывания очищенных репрессорных белков с операторами дикого типа и мутантными формами in vivo. Мутации, уменьшающие сродство репрессора к оператору, приводили к конститутивному синтезу ферментов, кодируемых lac-опероном, т. е. к экспрессии lас-ферментов в отсутствие индуктора. Мутации, сопровождающиеся накоплением репрессора в клетках или увеличением сродства репрессора к оператору, делали lас-оперон неиндуцибельным.

Позитивная регуляция лактозного оперона. Для экспрессии lас-оперона, как и других индуцибельных оперонов, которые осуществляют контроль синтеза ферментов, участвующих в метаболизме cахаров, необходимо не только снять репрессию оперона, но и получить некий сигнал; Таким сигналом служит комплекс циклического АМР (сАМР) с белком-активатором катаболизма (CAP, от англ. catabolite activator protein), который связывается со специфической последовательностью, находящейся в самом начале lac-промотора (прозрачка 8).

сАМР, принимающий участие во многих клеточных процессах, образуется из АТР (прозрачка 8а) в ответ на самые разные вне — и внутриклеточные события.

САР представляет собой димер из идентичных полипептидных цепей с мол. массой 22 кДа.

Связывание комплекса САР-сАМР со специфической последовательностью в начале промотора приводит к усилению транскрипции lac-оперона почти в 50 раз. Сам по себе CAP не способен к такому связыванию и стимуляции транскрипции. Усиление транскрипции с помощью комплекса САР-сАМР можно объяснить:

связываясь с ДНК в непосредственной близости от сайта присоединения РНК-полимеразы, он усиливает сродство этого фермента к промотору (прозрачка 9).

Альтернативная гипотеза заключается в том, что связывание САР-сАМР с САР-сайтом предотвращает присоединение РНК-полимеразы к расположенному поблизости слабому промотору и увеличивает тем самым вероятность того, что полимераза свяжется с «правильным» промоторным сайтом. Высказывавшееся ранее предположение, что комплекс САР-сАМР изменяет топологию ДНК, так что облегчаются связывание полимеразы и транскрипция, кажется несостоятельным.

Комплекс САР-сАМР является положительным сигналом при регуляции экспрессии и других оперонов, в частности тех, которые кодируют ферменты расщепления углеводов (галактозный и арабинозный оперон) а также работу оперонов, кодирующих ферменты, которые участвуют в деградации аминокислот, пуринов и пиримидинов.

Комплекс САР-сАМР при регуляции экспрессии галактозного и арабинозного оперонов Комплекс САР-сАМР является положительным сигналом при регуляции экспрессии этих оперонов (галактозного и арабинозного). Например, для экспрессии araи gal-onepонов должны произойти дерепрессия с помощью индукторов — арабинозы и галактозы соответственно и связывание комплекса САР-сАМР с областью промотора. Так, у бактерий, растущих на глюкозе, уровень внутриклеточного сАМР и соответственно комплекса САР-сАМР очень низок. Поэтому, если даже в среде присутствует арабиноза или галактоза, в клетках не образуются ферменты, необходимые для утилизации этих сахаров. При уменьшении количества глюкозы уровни сАМР и САР-сАМР увеличиваются и опероны в присутствии необходимых индукторов начинают экспрессироваться. Подобная комбинация позитивной и негативной систем регуляции очень важна, поскольку это предотвращает образование ферментов, потребность в которых в данный момент отсутствует.

Комплекс САР-сАМР при регуляции экспрессии ферментов, участвующих в деградации аминокислот, пуринов и пиримидинов Сигнальная система САР-сАМР регулирует также работу оперонов, кодирующих ферменты, которые участвуют в деградации аминокислот, пуринов и пиримидинов. Накопление в клетке САР-сАМР служит сигналом «голодания»: в ответ на него снижается экспрессия оперонов, кодирующих ферменты расщепления аминокислот, пуринов и пиримидинов. В этом случае логика работы системы также состоит в том, чтобы предотвратить образование ненужных ферментов в период голодания.

г). Регуляция экспрессии триптофанового оперона Триптофановый оперон состоит из оператора, и пяти структурных генов (А-Е). Последний кодирует ферменты, участвующие в биосинтезе триптофана — одной из незаменимых ам.к. по мере увеличения концентрации триптофана наступает момент, когда его дальнейший синтез становится нежелательным и транскрипция прекращается.

Триптофан синтезируется в Е. соli из ароматического предшественника — хоризмовой кислоты — в ходе пяти последовательных реакций, катализируемых ферментным комплексом из пяти белков (прозрачка 10, 2). Эти кодируемые trp-опероном белки образуются согласованно, примерно в равных количествах, при трансляции полицистронной мРНК длиной 7000 нуклеотидов, транскрибируемой с промотора. При наличии в среде достаточного для роста бактерий количества триптофана клетки Е. coli образуют ферменты биосинтеза триптофана в очень малых количествах. Однако если клетки лишены экзогенного триптофана, то в них начинается довольно интенсивный синтез всех пяти ферментов. Содержание ферментов этой группы в клетках Е. соli может различаться до 700 раз в зависимости от внутриклеточного уровня триптофана.

Подобный разброс в уровне экспрессии обусловлен наличием двух практически независимых механизмов регуляции, каждый из которых «подгоняет» уровень синтеза trpмРНК к концентрации внутриклеточного триптофана.

Механизмы: их два. Эффекты этих двух регуляторных механизмов комплементарны, мультипликативны и позволяют увеличивать степень экспрессии оперона.

основан на репрессии, изменяющей эффективность инициации транскрипции в промоторе.