Заключение. 
Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса

В последнее время насчитывается более 20 инфекций, передаваемых половым путем, среди которых сифилис занимает значительное место. Заболеваемость сифилисом в России остается крайне высокой и составляет более 143 случаев на 100 тыс. населения. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза, причем её подъем имеет многие признаки эпидемии: преобладают в структуре свежие формы; происходит рост числа детей с врожденным и приобретенным бытовым сифилисом; появились территории с показателями заболеваемости, значительно превышающими статистические показатели по стране (Аковбян В. А., Прохоренков В. И., Машкиляйсон А. Л. и др. 1995; Адаскевич В. П., 1999; Родионов А. Н., 2000).

Республика Северная Осетия-Алания является регионом, где наряду с общероссийскими проблемами (увеличение числа социально неадаптированных лиц, более раннее начало половой жизни, рост проституции и др.), имеются и свои особенности, главными из которых являются высокая плотность населения, приближенность к «горячим точкам», наличие большого количества беженцев и вынужденных переселенцев, выраженность миграционных процессов.

Анализируя заболеваемость сифилисом в РСО — А по районам за пять лет, можно отметить, что она носит циклический характер, во всех районах и в г. Владикавказе наблюдается её нестабильность, со «взлётами» и «падениями». Так, подъем заболеваемости в 2003 г. (43,0 на 100 тыс.) произошёл за счёт увеличения случаев сифилиса в Пригородном (в 2 раза), Ардонском (в 2,5 раза), Кировском (более чем в 3 раза) и Алагирском (почти в 5 раз) районах. В других районах Республики и в г. Владикавказе наблюдалось некоторое снижение заболеваемости.

С 1999 г. по 2003 г. стало заметно изменение удельного веса различных форм сифилиса в сторону увеличения раннего (с 43,5% до 56,0%), появления позднего скрытого сифилиса (5,8%) и врожденного сифилиса (1,7%). С 2001 г. отмечены случаи нейросифилиса. В структуре заболеваемости превалируют скрытые формы сифилиса, которые характеризуются полным отсутствием симптоматики и выявляются только по положительным серологическим реакциям при обследовании крови в поликлиниках, стационарах, при устройстве на работу и различных профилактических осмотрах.

Основную массу больных сифилисом составляют лица обоих полов в возрасте от 20 до 39 лет. Однако в последнее время отмечается тенденция к увеличению удельного веса лиц в возрасте свыше 40 лет. По семейному положению основную массу больных составляют лица разведённые (5%), состоящие в браке повторно (13,0%) и холостые (60%), т. е. семья является одним из сдерживающих факторов в предупреждении случайных половых связей. Анализ социального состава больных сифилисом показал, что основная масса больных (78,9%) представлена нигде не работающими лицами, что в значительной мере затрудняет проведение противоэпидемических мероприятий. Среди причин, влияющих на заболеваемость, необходимо отметить возросшую сексуальную активность подростков, увеличение числа внеи добрачных половых связей вследствие возросшей сексуальной раскрепощённости населения, коммерциализацию интимных отношений, широкое распространение порнографии, наркомании и т. д.

Таким образом, анализ заболеваемости сифилисом в Республике Северная Осетия-Алания свидетельствует о высокой тенденции распространения этого заболевания. Это обусловливает необходимость разработки и интенсивного проведения противоэпидемических мероприятий как в неблагополучных районах, так и в целом по Республике. При этом лабораторные методы играют существенную роль в системе этих мероприятий.

В централизованной лаборатории Северо-Осетинского кожновенерологического диспансера во исполнение приказа МЗ № 87 с 2001 г. для исследования на сифилис широко применяются: тест быстрых плазменных реагинов (RPR), метод иммуноферментного анализа (ИФА), как скрининговый, трепо-немные подтверждающие тесты — реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ), позволившие выявить большее количество поздних форм сифилиса: в 2000 г. поздний скрытый сифилис был в 2-х, в 2002 г. — уже в 4-х случаях; в 2000 г. нейросифилис не обнаруживался, а в 2002 г. — уже диагностировали 7 случаев этой тяжёлой формы болезни. Необходимо отметить, что в 12,4% случаях при установлении диагноза раннего скрытого сифилиса и 50,0% - при нейросифилисе при отрицательной реакции Вассермана ИФА была резко положительной.

Дальнейшее расширение арсенала лабораторных методов, и особенно за счет экспрессных, с помощью которых возможно исследовать большое количество людей за короткий промежуток времени и получить достоверную информацию о сложившейся ситуации по этой инфекции, дает возможность принимать оперативные меры в борьбе с заболеваемостью сифилисом.

Нами разработана биотехнология приготовления трепонемного суспензионного антигенного диагностикума для реакции агглютинации и дана оценка его диагностической ценности. Изготовление препарата осуществляли в соответствии с методикой, разработанной И. А. Базиковым (2000), в нашей модификации, используя в качестве полимерной матрицы акролар К, полученный из института биоорганической химии им. Шемякина. Гомогенные частицы латекса правильной сферической формы, окрашенные в розовый цвет имели средний диаметр (1,2±0,1) мкм.

Лигандом служил комплексный антитиген, полученный по разработанной нами биотехнологической схеме, состоящий из коммерческого ульт-раозвученного трепонемного антигена (УЗТА) для РСК производства ФГУП «Аллерген» (г.Ставрополь), подверженного специальной очистке, и цетавло-нового супернатанта, представляющего собой поверхностные антигены трепонем, изолированные нами по методике M.C.Blake, E.C.Goschliech (1982), в соотношении 2:1. Коммерческий антиген и поверхностные антигены извлекали из культуральных бледных трепонем штаммов V, VI, VII, VIII, IX и Рейтера.

УЗТА предварительно подвергали очистке, которая заключалась в иммуносорбции неспецифических антигенов, переосаждении сульфатом аммония, гельфильтрации, стабилизации методом сублимации.

Для извлечения поверхностных антигенов использовали цетавлон, позволяющий изолировать полимерный комплекс, включающий липид, полисахарид в сочетании с протеинами и нуклеиновыми кислотами. Комплексный антиген явился в дальнейшем высококачественным сырьем при конструировании препаратов для иммунодиагностики сифилиса.

Нами получен трепонемный суспензионный диагностикум на основе полиакролеиновой матрицы, При этом отработаны оптимальные условия сенсибилизации латексных микросфер комплексным трепонемным антигеном: 0,20 мг лиганда соединяли с 2 мл с 2% полимерного носителя. К смеси добавляли 2 мл 0,9% раствора натрия хлорида, рН 7,2. Сенсибилизацию проводили в течение 3 ч при температуре 22 ⁰С на магнитной мешалке. Далее суспензию осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 3−4 мин и дважды отмывали от несвязавшегося антигена. Для стабилизации трепо-немного полимерного латексного диагностикума отработан оптимальный режим его лиофильного высушивания.

По вышеописанной технологии изготовлено 10 серий диагностикума. Оценка их диагностической ценности проводилась на базе централизованной лаборатории Северо-Осетинского РКВД. Для исследования были взяты сыворотки крови 416 стационарных больных до лечения и после лечения с различными диагнозами: сифилис первичный серопозитивный; сифилис вторичный свежий, сифилис вторичный рецидивный, сифилис скрытый ранний, сифилис скрытый поздний, нейросифилис ранний в сравнении с КСР (микрореакция преципитации, реакции Вассермана, ИФА, РНГА, РИФ). Контрольной группой служили сыворотки крови 167 лиц, свободных от сифилитической инфекции.

При изучении чувствительности и специфичности диагностикума использовали два варианта постановки РАЛ: на стекле, как скрининг на сифилис (качественный тест), и титрование сывороток в микропланшетах (количественный тест). Для этого использовали 96-луночные микропланшеты для иммунологических реакций из полистирола отечественного и импортного производства.

На основании проведенных испытаний установлено, что изготовленный по разработанной нами технологии трепонемный суспензионный антигенный диагностикум позволяет проводить реакцию агглютинации латекса, по чувствительности, сопоставимую с такими трепонемными тестами, как РПГА, ИФА, РИФ, в то же время РАЛ превосходит реакции Вассермана и МР по этому показателю. При сравнительном изучении специфичности РАЛ достоверно установлена его высокая специфичность.

В последние годы в иммунодиагностике широко развиваются направления, связанные с иммунохроматографическими, иммунофильтрационными и так называемыми «дот-блот» методиками, в которых в качестве твердой фазы используют пористые мембраны, а в качестве маркера — ферменты, красители или золи металлов. В поисках доступных и дешевых каталитически активных металлов, способных выявляться «физическим проявлением», мы обратили внимание на коллоидное серебро. Золи серебра достаточно стандартны и легко воспроизводимы, а сконструированные с их участием тест-системы по чувствительности практически не уступают другим твердофазным методам.

Нами отработаны методические подходы при конструировании диаг-ностикума с применением коллоидного серебра в качестве маркера трепо-немного антигена для детекции в ДИА специфических антител.

Золь серебра получали восстановлением азотнокислого серебра бор-гидридом натрия. Для этого к 5 мл 0,05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливали равный объем 0,02% водного раствора азотнокислого серебра. Перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин. При конструировании диагностикума использовали комплексный трепонемный антиген.

Наиболее эффективно стабилизировал золь серебра антиген в количестве 375 мкг на 10 мл золя. Исходя из этого, для приготовления диагности-кума к 1 мл антигена (375 мкг белка) при постоянном интенсивном перемешивании добавляли 5 мл золя серебра. После 10-минутного перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре в раствор добавляли следующую порцию золя — 3 мл, а спустя 10 мин — еще 2 мл золя и 2 мл 10% водного раствора БСА (для блокирования свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера). Через 30 мин перемешивания диагностикум стабилизировали внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 1% БСА, 10% НЛС и 0,04% азида натрия. Приготовляемый препарат дополнительно интенсивно встряхивали в течение 30 минут, разливали в ампулы ШПВ-6 по 2 мл. Срок хранения диагностикума — 6 месяцев.

Постановку реакции осуществляли традиционным для дот-иммуно-анализа способом. Сыворотки крови разводили забуференным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,2 с 0,5% БСА в 200 раз и титровали путем двухкратного разведения до необходимой концентрации в планшете для иммунологических реакций. Каждое разведение сывороток наносили на твердофазный носитель в объеме 1 мкл в виде линейно расположенных точек. В качестве такового мы апробировали НЦМ для электрофореза «Bio-Rad», «Mil-lipor», «Serva» и мембранные фильтры"Агшсоп", «Millipor», «Sinpor>m «Вла-дипор» с различным размером пор, исходя из того, что прочность связывания ими антител и их сорбционная емкость может быть неоднозначна.

Проведенные испытания показали, что наименее пригодными оказались мембранные фильтры «Amicon», «Millipor» и «Владипор». Хорошими характеристиками обладали НЦМ и мембранные фильтры «Sinpor» (достаточная сорбционная емкость и прочность связывания наносимого материала).

После нанесения исследуемого материала (1 мкл) на мембрану мы испытали несколько режимов иммобилизации: 20,30,40 мин при (20±1) ⁰С, 10,15,20 мин при 37 ⁰С. Все режимы сорбции были приемлемы, для дальнейшей работы нами избран режим: 10 мин при 37 ⁰С.

Мембрану после фиксации материала помещали в чашку Петри и однократно промывали ЗФР. Затем подложку заливали ЗФР, содержащим 1% БСА, блокируя таким образом на ней свободные участки связывания в течение 10−15 мин при комнатной температуре. После двукратного промывания ЗФР мембрану помещали на 5−10 мин в раствор диагностикума, затем тщательно (трехкратно по 2−3 мин) промывали ЗФР и однократно — дистиллированной водой. Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембраны в раствор проявителя на 5−8 мин.

Проявитель выбирали по проявляющему веществу: амидол, гидрохинон, глицин, метол, фенидон в разных сочетаниях. Всего нами было апробировано 14 составов проявителей для каталитического усиления сигнала серебряного золя. Результаты испытаний показали, что проявители, содержащие метол, развивали высокую оптическую плотность: исследуемые сыворотки крови, содержащие специфические антитела, проявлялись в виде серо-коричневых пятен различной интенсивности в зависимости от количественного содержания антител. В то же время остальные проявители давали светлые, малоконтрастные отложения. В связи с этим в экспериментах мы использовали проявитель, содержащий метол.

Используя сконструированный иммунодиагностикум, исследовано в ДИА с коллоидным серебром 215 проб сывороток крови больных различными формами сифилиса, 55 — обследуемых на сифилис. Контрольной группой служили сыворотки крови 70 лиц, свободных от сифилитической инфекции. Эти же сыворотки параллельно оценивались в МР. Результаты испытаний несомненно свидетельствуют о высокой чувствительности разработанного диагностикума. Так, у 157 (73%) больных обнаруживались антитрепонемные Ат в титрах 1:400, у 58 (27%) человек — 1:800, в то же время как из 215 больных, обследованных в МР, лишь у 165 (77,3%) больных отмечен положительный результат. Из 55 больных обследуемых на сифилис у 40 (72%) титр сывороток в ДИА был равен 1:400, у 5 (9%) — 1:800, у 10 (18,2%) — отрицательный результат. Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном у 45,7% обследуемых (25 человек) была отрицательной. Специфичность иммунодиагностикума на основе коллоидного серебра подтверждена при исследовании 70 сывороток крови лиц, свободных от сифилитической инфекции.

Таким образом, нами сконструирован высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностикум для ДИА с использованием комплексного трепонемного антигена, меченного частицами коллоидного серебра. Этот тест, в сравнении с традиционными серологическими реакциями на сифилис, более чувствителен, экспрессен, экономичен и свидетельствует о перспективности использования ДИА со специфическим антигеном трепонем, меченным коллоидным серебром, в качестве экспрессного ультрамикроме-тода лабораторной диагностики сифилиса.