Заключение. 
Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза

Каждую минуту в мире от туберкулёза умирают четыре человека. В России в 2004 г. зарегистрировано около 102,9 тыс. больных с установленным впервые активным туберкулёзом, а показатель по сравнению с 2003 г. увеличился на 3,3%, достигнув 71,7 на 100 тыс. населения. Среди детей до 14 лет также выросла заболеваемость на 3,8%. Больные туберкулёзом органов дыхания составляют 95,6% из числа всех зарегистрированных случаев заболевания туберкулёзом (Ильин И.А., 2005). В связи с неблагоприятной обстановкой по туберкулёзу в Российской Федерации в последние годы (Онищенко Г. Г. 2003) и недостаточным качеством диагностических препаратов, основные направления медицинской биотехнологии предусматривают расширение возможностей диагностики микобактерий туберкулёза за счёт появления новых экспрессных высокоспецифичных, чувствительных, доступных методов и препаратов, что способствует оперативному эпидемиологическому анализу и формированию целенаправленных противоэпидемических и медицинских противотуберкулёзных мероприятий.

Увеличение заболеваемости туберкулёзом, вызванным МТБ и нетуберкулёзными микобактериями, повышает значимость их индикации и идентификации, что крайне важно для проведения подходящей антибактериальной терапии.

В настоящей работе представлены результаты научно-методических разработок биотехнологии медицинских иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза.

Производство диагностических препаратов представляет собой единую биотехнологическую систему, которая складывается из последовательных стадий и операций, количество и особенности которых зависят от вида производимой продукции.

При получении качественных диагностических препаратов необходимо выделить из микробных биомасс высокоочищенные активные и специфические антигенные комплексы, применяемые при иммунизации животных и в качестве положительного контроля в тест-системах, подобрать схему иммунизации животных, получить специфические иммунные сыворотки, отработать параметры биотехнологии изготовления диагностических систем.

При всём многообразии способов извлечения специфических антигенов из микробных клеток необходимо было подобрать комплекс биотехнологических операций, который бы позволил изолировать в достаточном количестве для производственных целей полноценные в антигенном отношении фракции из МТБ. Для этого была использована водно-солевая экстракция МТБ и других бактерий. По данным ряда исследователей (Вейнблат В.И., 1971; Афанасьев Е. Н., 1986 и др.), такие экстракты обладают сложным макромолекулярным составом и в них обнаруживаются в тех или иных количествах большинство присутствующих у бактерий антигенов. Водорастворимые туберкулёзные антигены изолировали комплексным методом: водно-солевой экстракцией, ультразвуковой и механической дезинтеграцией, осаждением антигенов сульфатом аммония. Полученный препарат содержал не менее 20 мг/мл белка и формировал зоны преципитации в РИД с иммунной сывороткой в разведении 1:32 — 1:64.

Для получения туберкулёзных иммунных сывороток нами апробированы различные схемы иммунизации. При получении агглютинирующих сывороток, в которых в основном присутствуют иммуноглобулины класса М, использовали «короткую» схему иммунизации (Афанасьев Е.Н., 2000) с иммунокорректорами — тималином и циклофосфаном; при получении преципитирующих сывороток, в которых превалируют иммуноглобулины класса G, — применяли «длинную» схему (Тюменцева И. С., 1994) с иммунокорректором феракрилом. Использование иммунокорректоров позволило повысить эффективность иммунизации при незначительном расходе антигенного материала и существенном повышении титров специфических антител (до 1:600 в РНИФ и 1:64 в РИД).

В связи с тем, что антигенный спектр микобактерий туберкулёза имеет много общего с представителями родов Nocardia, Brucella, Listeria и некоторыми нетуберкулёзными микобактериями, идентификация МТБ и его дифференциация крайне важна для практического здравоохранения и проведения подходящей антибактериальной терапии. Для конструирования эффективных туберкулёзных диагностических препаратов необходимы высокоспецифические иммунные сыворотки, нуждающиеся в удалении из них перекрёстно реагирующих антител. Для этих целей наилучшим способом является использование аффинного сорбента, представляющего собой гетерологичные антигены, ковалентно закреплённые на твёрдой матрице. Очистка иммунной сыворотки происходит за счёт биоспецифического взаимодействия между антигенами, закрепленными на матрице, и антителами, подлежащими удалению.

Результаты предыдущих исследователей и наш собственный опыт показали, что сорбция корпускулярными антигенами существенно понижает специфические титры антител и делает непригодным сырьё для дальнейшего использования из-за появления в нём экстрагируемого из бактериальных клеток материала, применение же для этих целей полиакриламидных сорбентов базируется на применении высокотоксичных импортных реактивов и довольно трудоёмка. В связи с этим, мы впервые для данных целей использовали разработанный аффинный сорбент с магнитными свойствами, где в качестве твердой фазы выступает кремнезем-алюмосиликат. МС готовили при соотношении компонентов (Fe2O3, декстран, алюмосиликат) — 2:2:1 соответственно; время гелеобразования — 2 ч, значение рН гелеобразования — 7,0.

Активирование сорбента производили методом окисления, используя перхлорат натрия. Для придания магносорбенту аффинных свойств на его поверхность иммобилизовали лиганды — водорастворимые антигены (2,5 мл с концентрацией белка 2 мг/мл), полученные из гетерогенных штаммов микроорганизмов (Brucella abortus 19, Nocardia brasiliensis, M. intracellulare #23, M. Kansasii Yoss), дающих перекрёстные реакции с иммунными сыворотками. Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время иммобилизации антигенов на МС — 2 ч при значении рН 6 — 7 и температура 24 — 37 0С.

Методы получения иммуносорбентов просты и технологичны, исключающие применение токсичных веществ. Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической и микробиологической устойчивостью, не подвержены набуханию. Использование отечественных экологически чистых компонентов, их дешевизна, простота технологии изготовления свидетельствуют о достоинствах алюмосиликатных МИС.

При сорбции туберкулёзной иммунной сыворотки данный антигенный МС, взаимодействуя с соответствующими иммуноглобулинами, освобождал сыворотку от неспецифических антител на одном этапе, сохраняя первоначальную специфическую активность нативных иммунных сывороток. Магнитные свойства иммуносорбента позволяли значительно упростить процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного центрифугирования.

Проведённые исследования дают основание утверждать, что применение алюмосиликатных антигенных МИС позволяет проводить качественную имму-носорбцию, сохраняя активность и специфичность иммунных сывороток. При этом не происходит попадания в сыворотку антигенного материала, в ней отсутствуют комплексы «антиген-антитело», появляющиеся в материале при сорбции корпускулярными антигенами и мешающие в дальнейшем созданию специфических диагностических систем, титры специфических антител не снижаются и конечный продукт является качественным сырьем для дальнейшей работы. Данный сорбент можно регенерировать и многократно использовать.

Из сорбированной туберкулёзной сыворотки иммуноглобулины выделяли с помощью каприловой кислоты по методу G. Steibuch, R. Andran (1969).

Варьируя количеством используемых компонентов, рН растворов, температурой и временем проведения реакций, выделенные туберкулёзные иммуноглобулины конъюгировали с ферментом пероксидазой, липосомами, латексом, алюмосиликатом, органокремнезёмной матрицей, содержащей оксид железа, получая соответственно иммунопероксидазный конъюгат для ИФА, диагности-кумы для РАЛ, РСА и МИС.

Для ковалентного связывания пероксидазы с туберкулёзными иммуноглобулинами использовали метод перйодатного окисления углеводной части фермента (Р.К.Какапе, А. Kawaоi, 1974). Сформировавшиеся при этом альдегидные группы образовывали ковалентную связь с аминогруппами антител. Очистку конъюгата от непрореагирующих компонентов осуществляли на колонке с сефадексом G-100, после чего его лиофилизировали. Полученный препарат был стабилен без потери активности в течение 1 г. Рабочий титр полученных иммунопероксидазных туберкулёзных конъюгатов составил 1:4001:800.

В иммуноферментной реакции, в которой в качестве твёрдой фазы применяли стандартные планшеты, чувствительность конъюгата по водорастворимым антигенам составила 50−100 мкг/мл, по возбудителю туберкулёза — (5×104−1×105 м.к./мл). С гетерологичными штаммами диагностикум не взаимодействовал, что говорит о его специфичности.

В результате проведённой сорбции сыворотки крови от гетерологичных антител и чётко отработанных параметров конъюгации лиганда и маркёра получены высокоэффективные (1:600), специфичные (отсутствуют перекрёстные реакции с гетерологичными штаммами) иммуноферментные конъюгаты.

На основе полученных препаратов была сконструирована тест-система для экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, состоящая из 1 ампулы имму-ноферментного конъюгата, 1 ампулы положительного контроля (обеззараженная взвесь туберкулёзного микроба) — 1×109 м.к./мл, 1 ампулы иммуноглобулинов туберкулёзных и необходимых ингредиентов для постановки ИФА (ФСБ, твин-20, БСА, стоп-реагента — 4 М раствора серной кислоты, хромогена — орто-фенидендиамина, таблетки гидроперита). Одной ампулы с препаратом в объеме 0,1 мл, с активностью-1:600 достаточно для исследования 300 проб в ИФА.

Ферменты с лабильной структурой молекулы даже в охлаждённом состоянии при 4 0С имеют ограниченный срок хранения, который удаётся увеличить при придании им определённой жёсткости в процессе иммобилизации энзимов на твёрдофазные носители.

В качестве такого носителя использовали липосомы, которые получали из фосфолипидов и ганглиозидов, выделенных из мозга к.р.с., а в последнее время из мозга свиней, не являющегося потенциально опасным при губчатой энцефалопатии животных (коровье бешенство). Разработанная биотехнология выделения сырья для приготовления липосом (ТУ 9154−00−1 897 080−2004) включала измельчение и обезвоживание мозга животных ацетоном, экстрагирование из него фосфолипидов и ганглиозидов смесью хлороформ-этанол (1:1) и дробное осаждение указанных липидсодержащих фракций ацетоном. Данные способы выделения фосфолипидов и ганглиозидов защищены патентами РФ № 2 192 265 от 10.10.2002 и № 2 195 296 от 27.12.2002.

Методом тонкослойной хроматографии в препарате фосфолипидов обнаружены в основном фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфотидилино-зит, а также холестерин.

Полученные препараты растворяли в хлороформе в конечной концентрации 50 мг/мл и смешивали фосфолипиды и ганглиозиды в соотношении 20:1, добавляя туда антиоксидант — 0,5% а-токоферол. Этот липидный раствор использовали для приготовления липосом методом «выпаривания в обращённой фазе» в соответствии с методическими рекомендациями «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденными Главным Государственным санитарным врачом России Г. Г. Онищенко. 06.04.2000 г. В результате получены липосомы, идентифицированные при электронной микроскопии, размером 150−300 нм.

При получении липосомального иммуноферментного диагностикума предварительно активировали (5+0,1) мг пероксидазы хрена по методике, описанной выше. В результате в углеводной части молекулы пероксидазы формировались альдегидные группы, обеспечивающие фиксацию фермента к мембране липосом за счёт аминогрупп ганглиозидов и последующую за этим иммобилизацию туберкулёзных иммуноглобулинов на сформировавшемся комплексе с участием оставшихся свободных альдегидных групп фермента.

С этой целью к 5 мг окисленной пероксидазы добавляли 1 мл суспензии липосом в 0,01 М КББ рН 9,5, содержащей 18 мг липидов, смесь подвергали кратковременной ультразвуковой обработке. После удаления несвязавшейся на липосомах пероксидазы путём хроматографии на колонке с сефадексом G-100, уравновешенной 0,01 М КББ рН 9,5, к препарату добавляли туберкулёзные иммуноглобулины G в оптимальном количестве (5 мг/мл). Смесь инкубировали 2 ч при температуре (22+4) 0С и несвязавшиеся иммуноглобулины отделяли от липосомального конъюгата хроматографически на колонке с сефадексом G-100, уравновешенной 0,1 М ФСБ рН (7,2+0,1).

В лиофилизированном состоянии туберкулёзный липосомальный иммуно-ферментный препарат по чувствительности и специфичности не отличался от туберкулёзного иммуноферментного конъюгата и сохранял все свои свойства в течение 2 лет (срок наблюдения), в 2 раза превышая срок хранения туберкулёзного иммуноферментного диагностикума.

Нами осуществлена разработка биотехнологии изготовления латексных (полиакролеиновых) диагностикумов для выявления возбудителя туберкулёза. Латексы выбраны в качестве носителей, так как их химические свойства относительно постоянны и поддаются точной характеристике. Наличие альдегидных групп на их поверхности позволяет легко образовывать ковалентную связь с аминогруппами белков. Таким образом, проанализировав литературные данные и проведя экспериментальные исследования, направленные на повышение технологичности производства латексных диагностикумов, нами были отработаны оптимальные условия их изготовления. Для сенсибилизации использовали иммуноглобулины класса М из адсорбированных туберкулёзных сывороток при их оптимальной нагрузке -400 мкг/мл (при увеличении количества иммобилизованного лиганда отсутствовал отрицательный контроль, а при уменьшении — снижалась чувствительность диагностикума). Время сенсибилизации составило 6 ч при температуре — 50 0С и рН среды — (7,2+0,1). При уменьшении времени сенсибилизации, температуры и рН среды до 5 снижалась чувствительность препарата, при увеличении рН до 9,0 — отсутствовал отрицательный контроль.

Чувствительность разработанных диагностикумов в РАЛ с возбудителем туберкулёза составила 3,9×105−7,8×105 м.к./мл при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами.

С целью получения диагностикума, обнаруживающего возбудитель ту-беркулёза в течение нескольких минут, была использована алюмосиликатная кремнезёмная матрица с пористой структурой, обладающая высокой сорбцион-ной активностью. Твёрдофазный краситель окрашивали аурамином в весовом соотношении 2:1 и активировали вторичным алкилсульфатом натрия. Были подобраны оптимальные параметры биотехнологии подготовки твёрдофазного носителя и иммобилизации на него туберкулёзных иммуноглобулинов класса М, выделенных из адсорбированной сыворотки. Оптимальными параметрами при этом были следующие: концентрация белка иммуноглобулинов -1,5 мг/мл, время иммобилизации — 2 ч при температуре (26+4) 0С.

При исследовании влияния кислотности буферного раствора во время сенсибилизации, установлено, что при увеличении кислотности снижается процент связывания сенситина. Увеличение рН реакционного раствора до 10 приводит к ложноположительной агглютинации. Оптимальный рН при сенсибилизации матрицы и постановки РСА — 7,0.

Данный диагностикум в РСА на стекле, взаимодействуя с туберкулёзным антигеном, формировал крупнозернистые хлопья с просветлением жидкости. С гетерологичными штаммами бактерий агглютинации диагностикума не наблюдалось.

Чувствительность сконструированных диагностикумов суспензионных иммуноглобулиновых туберкулёзных в РСА на стекле составила 7,8×105 -1,56×106 м.к./мл, что соответствует чувствительности диагностикумов латекс-ных иммуноглобулиновых в реакции агглютинации латекса (РАЛ). При этом предварительный учет РСА на стекле возможен через 1−3 мин, а окончательный результат РАЛ (макрометод) — 16- 18 ч. Таким образом, преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции и быстроте получения результатов.

Основные требования, предъявляемые к современным методам экспресс-анализа, заключаются в выявлении низких концентраций патогенного агента в максимально короткие сроки с высокой специфичностью. В последнее время для этих целей нашли применение магноиммуносорбенты, благодаря которым упрощаются, ускоряются все этапы исследований при высокой чувствительности диагностических препаратов и наличия возможности автоматизации учёта реакций.

Цель наших исследований — конструирование тест-системы диагностической магноиммуносорбентной туберкулёзной для иммуноферментного анализа.

Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твёрдой фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность в иммобилизованном состоянии, обладать минимальной неспецифической адсорбцией и быть удобной при разделении фаз.

Нами разработана биотехнология изготовления органокремнезёмного магносорбента на основе алюмосиликата и окиси железа (III). Модифицирование его поверхности осуществляли в присутствии полимера — декстрана и поверхностно-активного вещества — вторичного алкилсульфата натрия.

На основе проведенных исследований рекомендованы следующие опти-мальные условия получения алюмосиликатных магносорбентов: весовые соотношение компонентов синтеза окиси железа, декстрана, алюмосиликата 2:2:1, время гелеобразования 2 ч (при увеличении времени удлиняется процесс синтеза магносорбента, уменьшается размер его пор, что приводит к снижению степени иммобилизации лиганда в порах сорбента), значение рН гелеобразования — 7,0.

Далее проводили иммобилизацию специфических туберкулёзных иммуноглобулинов G на МС (данные препараты без потери специфической активности хранятся в течение 3 лет (срок наблюдения). В качестве сшивающего агента нами использовано поверхностно-активное вещество — вторичный алкилсульфат натрия, при этом прочность связи антител с магносорбентом повышается за счёт создания дополнительных связей, которые образуются между активными группами белка, полиглюкина (декстрана) и вторичного алкилсуль-фата натрия.

Исследования показали, что концентрация белка иммуноглобулинов 2,5 мг/мл является оптимальной для полного насыщения антителами сорбента в объеме 0,4 мл 10% взвеси. При увеличении концентрации белка адсорбционная емкость МИС снижалась.

Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время иммобилизации 2 часа при значении рН раствора иммуноглобулинов 6−7 и температуры (22 + 4) 0С и (37 + 1) 0С.

Методы получения МИС просты и технологичны, исключают применение токсичных веществ, диагностикумы изготовлены из отечественных экологически чистых компонентов. Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической, микробиологической устойчивостью и сохраняют специфическую активность в течение 3 лет (срок наблюдения).

МИС сохраняли способность концентрировать на своей поверхности бактериальные клетки возбудителя туберкулёза, которые затем выявляли с помощью ИФА.

В опытах на чистых культурах возбудителя туберкулёза получены положительные результаты при наличии в объеме пробы 0,5×10 — 1×10 м.к. и выше. При этом данное количество микробных тел могло присутствовать в 1 или 500 мл исследуемых проб. Если объём этих проб был большим (500 мл), то данную пробу пропускали через МИС, удерживаемый в специальной ловушке магнитным полем, что обеспечивало концентрацию МТБ на МИС. В дальнейшем сорбент обрабатывали туберкулёзным иммуноферментным конъюгатом, отмывали от несвязавшихся компонентов реакции, вносили субстрат-индикаторный раствор, по изменению цвета которого проводили учёт реакции.

Результаты проведённых исследований показали, что чувствительность ИФА одинакова при исследуемых температурных режимах — (22+4) 0С и (37±1) 0С. Другим важным параметром являлся временной режим. Установлено, что равновесный процесс между туберкулёзным антигеном и МИС наступал через 30 мин, а между образовавшимся комплексом и конъюгатом — через 15 мин. Важным являлось количество отмывок МИС после контакта с конъюга-том. При отмывке МИС меньше 6 раз ухудшалась специфичность реакции, т. е. наблюдались фоновые значения оптической плотности в отрицательном контроле.

Разработанная диагностическая система отличалась высокой специфич-ностью, не давая положительных реакций с гетерологичными микроорганизмами с концентрацией 1×102−1×106 м.к. в исследуемой пробе.

Для сравнения полученного диагностикума с традиционным методом постановки ИФА использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные туберкулёзными иммуноглобулинами в течение 18 ч, далее проводили анализ в соответствии с традиционной методикой. Чувствительность ИФА в данном случае составила 5×104 — 1×10 5 м.к./мл. При этом время постановки ИФА с применением МИС — 1−1,5 ч, а традиционным методом, учитывая 18 ч сенсибилизацию планшет, около 20 ч. Если объём исследуемых проб при использовании стандартных плашек не превышает 0,2 мл, то при использовании МИС он не ограничен.

В качестве иммунопероксидазного конъюгата для выявления МТБ использовали также его липосомальную форму. Данный диагностикум обнаруживал фиксированные на МИС за счёт специфической реакции «антиген-антитело» МТБ в количестве 1×10 м.к. в пробе при отсутствии реакций с гете-рологичными штаммами бактерий.

Таким образом, при использовании МИС в ИФА отпадала необходимость в полистироловых планшетах, сокращалось время сенсибилизации твёрдой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твёрдой фазы; время проведения непосредственно анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА.

Учитывая, что липосомальный туберкулёзный иммуноферментный диаг-ностикум при использовании в качестве твёрдой фазы МИС позволял в ИФА обнаруживать МТБ в гораздо меньшем количестве, чем при постановке традиционной реакции в полистироловых микропланшетах, т. е. обладал большей чувствительностью, нами было получено 5 серий этих диагностических систем. В полученный набор входят: лиофильно высушенный липосомально-иммуноперооксидазный конъюгат-0,1 мл -1 ампула; обеззараженная взвесь туберкулёзного микроба 1×109 (положительный контроль) — 0,5 мл-1 ампула; туберкулёзный МИС (10% взвесь)-по 2мл-2 ампулы и все необходимые ингредиенты для постановки ИФА (ФСБ, БСА, твин-20, стоп-реагентпо 1 флакону, хромоген-ортофенилендиамин-2 флакона и таблетка гидроперита).

Таким образом, нами разработана технология изготовления туберкулёзных магноиммуносорбентных диагностикумов и на их основе сконструированы диагностические тест — системы для проведения сочетанного метода детекции микроорганизмов в иммуноферментном анализе, подобраны условия постановки ИФА с МИС. Установлено, что туберкулёзные магноиммуносорбенты в жидком виде стабильны без потери физико-химических и иммунологических свойств в течение 3 лет (срок наблюдения). ИФА с применением МИС обладает высокой чувствительностью (1×102 м.к. в пробе), быстротой постановки реакции (1−1,5 ч), что подтверждено многочисленными испытаниями. При этом отпадает необходимость использования сенсибилизированных микропланшет. При использовании разработанной липосомально-иммунопроксидазной тест-системы повышается срок годности препарата в 2 раза.

На основе полученных экспериментальных данных разработаны методические рекомендации «Применение магноиммуносорбентов для выявления микобактерий туберкулёза», одобренные Ученым Советом СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05) и утвержденные директором института. Составлены нормативные документы: регламент производства и инструкция по применению на тест-систему диагностическую липосомальноиммуноперооксидазную для выявления антигена возбудителя туберкулёза иммуноферментным методом, рассмотренные на Учёном Совете СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05 г) и утвержденные директором института.

В последние годы при выявлении микобактерий туберкулёза широко применяют люминесцентную микроскопию. Этот метод значительно увеличивает диагностическую эффективность микроскопических исследований. Быстрота обнаружения микобактерий, простота флуорохромирования делает его доступным для практических лабораторий. Люминесцентная микроскопия с применением аурамина позволяет увеличить процент находок на 8% по сравнению с методом флотации и на 17% по сравнению с прямой бактериоскопией мазка (Приказ МЗ РФ № 558, 1978). Метод бактериоскопии мазка с окраской люминесцентными красителями, в частности аурамином, основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. Этим методом можно исследовать любой материал, кроме мочи, в котором могут быть трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ РФ № 558, 1978).

Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по методу Циля-Нильсена (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001).

При окраске микобактерий аурамином возможны ложноположительные результаты в процессе некачественного обесцвечивания мазка, что может привести к сохранению некоторыми сапрофитными бактериями оранжевого цвета. Микроскопические исследования (окраска по Цилю-Нильсену и аурамином) не позволяют дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных микобактерий) микобактериозов. На основе этих методов можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобактерий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение № 11, 2003).

Наиболее перспективными являются методы диагностики, основанные на образовании комплекса антиген-антитело, особенно в связи с возможностью использования в иммунофлуоресценции твёрдых носителей (Стоев К.Г. с со-авт., 1981; Подзолкова Г. Г. с соавт., 1989 и т. д.). С этой целью из адсорбиро-ванной туберкулёзной сыворотки путём фракционирования каприловой кислотой были выделены иммуноглобулины, которые метили флуоресцирующим маркером (ФИТЦ) по общепринятой методике. Они использованы в сочетании с магноиммуносорбентами для обнаружения антигенов возбудителя туберкулёза, были определены также оптимальные параметры постановки количественного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА), чувствительность и специфичность метода.

В опытах на чистых культурах и в модельных опытах на воде, контами-нированной различными концентрациями туберкулёзных микроорганизмов, получены положительные результаты при наличии в объеме пробы 1×10 м.к. и выше, при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами. Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой типа ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный типа В7−76.

В процессе отработки различных условий проведения анализа установлено, что чувствительность КИФА была одинаковой при исследуемых температурных режимах сорбции антигена на МИС- (22+4) 0С и (37±1) 0С, а для контакта сорбента с антигеном и окрашивания образовавшегося комплекса антиген-антитело флуоресцирующими иммуноглобулинами было достаточно 15−30 мин инкубации.

Нами приготовлено 5 серий тест — систем МИС для диагностики возбудителя туберкулёза в КИФА, в которые входят 3 ампулы по 2 мл туберкулёзных МИС-10% взвесь; положительный контроль — обеззараженные клетки микобактерий туберкулёза, 1×10 9 м.к./мл, 1 ампула -1 мл; иммуноглобулины туберкулёзные флуоресцирующие сухие — рабочее разведение 1:16 — 1:64 — 1 амп -0,5 мл.

Таким образом, нами разработана биотехнология изготовления магно-иммуносорбентных диагностикумов и на их основе сконструированы диагностические тест — системы для проведения сочетанного метода детекции возбудителя туберкулёза в количественном иммунофлуоресцентном анализе, оптимизированы параметры постановки КИФА. Данный метод позволяет осуществлять селективное концентрирование МТБ на сорбенте, обладает, высокой чувствительностью (0,5×10 — 1×10 м.к./пробе), значительно превышающую чувствительность общепринятой РИФ, возможностью быстро, в течение 1−1,5 ч учитывать реакцию не только визуально, но и инструментально (в условных единицах по показаниям вольтметра).

Разработанные диагностические препараты и тест-системы для выявления микобактерий туберкулёза испытаны не только в лабораторных условиях, но и в условиях клиники. Для получения положительных результатов клинических испытаний диагностических препаратов необходимо иметь чёткое представление о специфике выявляемого заболевания, его локализации в организме человека, о свойствах возбудителя микобактерий туберкулёза, методах подготовки исследуемых материалов, так как от совокупности знаний этих составляющих зависит качество диагностики.

Выявление антигенов возбудителя туберкулёза крайне затруднительно. Известны случаи, когда в группе больных фиброзно-кавернозным туберкулёзом только в фазе распада впервые выявлялся антиген (Хоменко А.Г., 1992). Для внелёгочного туберкулёза на фоне широчайшего полиморфизма бактерий характерны малая частота обнаружения возбудителя в патологическом материале и невозможность воспользоваться данными рентгенологической картины на ранних этапах заболевания.

Целью наших исследований являлось максимально возможное выявление антигенов МТБ у наиболее эпидемически опасной категории пациентов, обратившихся в Краевой клинический противотуберкулёзный диспансер г. Ставрополя с подозрительными в отношении туберкулёза клиническими или рентгенологическими симптомами.

Сбор, хранение, транспортировку и работу с диагностическим материалом (моча, мокрота) проводили согласно приказу МЗ РФ № 109, приложение № 10 от 21.03.2003.

Проведено тестирование микобактерий и их антигенов в материале от больных разными методами: РАЛ, РСА, ИФА, МИС с ИФА и КИФА.

Было исследовано 11 проб от здоровых людей (контроль) и 286 проб клинического материала (моча, мокрота) от больных из краевого клинического противотуберкулёзного диспансера, у которых диагноз туберкулёз (диссемини-рованный ТБ лёгких, фиброзно-кавернозный ТБ, очаговый ТБ, ТБ мужских половых органов и т. д.) дифференцировался с неспецифическими заболеваниями (онкологическими, пневмонией, хроническим бронхитом, и т. д. — всего 12 человек). При постановке РСА, РАЛ, ИФА (традиционным методом на плашках) выявляемость туберкулёзных антигенов в моче и мокроте больных составила 65%, 66%; 76% соответственно, при постановке ИФА и КИФА с МИС — 91%. Все разработанные диагностикумы дали отрицательный результат при исследовании мочи и мокроты здоровых людей.

Таким образом, используя комплекс разработанных препаратов и методов (РСА, РАЛ, ИФА, ИФА с МИС, КИФА с МИС), можно проводить качественную диагностику туберкулёза. Максимальный процент выявления микобак-терий туберкулёза при исследовании больных был получен с помощью соче-танных методов ИФА и КИФА с МИС.

При сравнении результатов иммуноферментных анализов традиционного с использованием полистироловых плашек и сочетанного с применением МИС установлено, что результаты исследований значительно различаются. За счёт селективного концентрирования на своей поверхности туберкулёзных антигенов, присутствующих в моче и мокроте больных, возможности концентрирования этих антигенов из проб большого объёма и более высокой чувствительности МИС с ИФА и КИФА обнаруживал положительные результаты в 91% случаев, в отличие от традиционного ИФА, при использование которого в этих же пробах туберкулезный антиген выявлялся в 76% случаях.

В таблице 18 приведены сравнительные данные по времени постановки реакции, сроках сохранности твердой фазы с иммобилизированными туберкулёзными иммуноглобулинами, чувствительности традиционного ИФА и сочетанного использования ИФА и КИФА с МИС.

Обобщая преимущества данных тест-систем следует отметить, что нами получены принципиально новые диагностические препараты для выявления возбудителя туберкулёза, позволяющие обнаруживать с высокой чувствительностью (1×10 м.к. в пробе) антигены возбудителя при их низкой концентрации в материале, проводить исследования проб большого объёма, освобождаться от неспецифических компонентов реакции за счёт тщательного промывания МИС, фиксированных в магнитном поле. Данные системы относятся к средствам экспресс-диагностики туберкулёза, т.к. позволяют получить результат через 1−1,5 ч после начала исследования. Немаловажным является и то, что туберкулёзный МИС не теряет своих физико-химических и иммунологических свойств (чувствительность и специфичность) при хранении на протяжении 3 лет (срок наблюдения).

Анализ полученных данных позволил установить, что использование ад-сорбированной туберкулёзной сыворотки при конструировании диагностиче-ских препаратов по разработанной биотехнологии даёт возможность получать различные специфические и чувствительные диагностикумы для выявления возбудителя туберкулёза в модельных объектах и у больных людей.

В итоге проведённых исследований подтверждены основные методологические подходы к разработке, изучению и производству различных иммуно-препаратов для диагностики возбудителя туберкулёза. Составлена блок-схема производства и исследования данных препаратов (рис. 19).

Рисунок 19. Блок-схема производства и исследования туберкулёзных ди-агностических препаратов.

В процессе научно-методических разработок созданы новые латексные (для РАЛ), иммуноферментные (для ИФА) диагностикумы, сконструированы новые препараты алюмосиликатные (суспензионные для РСА), липосомально-иммуноферментные (для ИФА), магноиммуносорбентные (для ИФА, КИФА), позволяющие выявлять возбудитель туберкулёза, его антигены в объектах внешней среды и в клиническом материале. Использование селективного концентрирования возбудителя на МИС с последующим проведением экспресс-анализа расширяет возможности индикации возбудителя туберкулёза за счёт высокой чувствительности (1×10 — 5×10 м.к./в пробе, объём которой практически не ограничен), позволяет получать результаты анализа в короткие сроки (11,5 ч), даёт возможность проведения и завершения анализов без выделения культуры, при использовании только нативного материала, что способствует оперативному эпидемиологическому анализу и формированию целенаправленных противотуберкулёзных медицинских мероприятий.