Генетика микроорганизмов. 
Систематика бактерий и микроорганизмов

Генетика прокариот изучает закономерности наследственности и изменчивости организмов, относящихся к этому обширному и многообразному царству.

Наследственность прокариот обеспечивает сохранение и точное вопроизведение признаков данного вида. Изменчивость определяет появление различий в признаках между особями одного вида бактерий, что в конечном итоге, в процессе эволюции, приводит к возникновению разнообразных форм жизни.

Для прокариот, как и для эукариот, характерны два типа изменчивости: генотипическая (наследственная) и фенотипическая (модификационная). Фенотипические изменения признаков получили название модификаций.

Фенотипическая изменчивость. Фенотипическая изменчивость возникает как ответная реакция организма на изменение условий окружающей среды и проявляется у большинства особей в популяции. Она не является наследственной и не приводит к изменению генетического аппарата бактерий. Фенотипическая изменчивость носит адаптационный характер. Модификации бактерий проявляются лишь временно, в период непосредственного действия фактора, и исчезают при его устранении. Например, широко распространенные в почве бактерии рода Azotobacter активно фиксируют атмосферный азот в условиях недостатка его в почве и резко снижают азотфиксацию при внесении в почву минеральных азотных удобрений. Недостаток кальция в среде вызывает слизистый рост бацилл сибирской язвы, но стоит добавить кальций — и слизеобразование прекращается.

Возникающие модификации бактерий могут быть относительно стабильными или, наоборот, очень лабильными. Иногда они могут сохраняться в течение нескольких поколений. Так, при длительном воздействии на культуру бактерий пенициллина или ультрафиолетового облучения происходит образование L-форм бактерий, которые сохраняются в течение нескольких поколений.

В природе фенотипические изменения часто повторяются в жизни прокариот. Нередко они носят циклический характер, связанный с сезонными климатическими факторами. Например, в почвах южных районов в сезон знойного засушливого лета большинство бактерий приобретают слизистый матрикс, предохраняющий клетку от высыхания. Роль фенотипической изменчивости сводится к обеспечению выживаемости микробной популяции р изменившихся условиях среды.

Генотипическая изменчивость. Генотипическая изменчивость прокариот проявляется в виде мутаций и рекомбинаций и осуществляется в результате изменений в первичной структуре генетического аппарата.

Генотипические изменения возникают в природе как редкие события в жизни бактериальной популяции. Они не носят направленного характера и не являются адекватными изменению условий среды.

Мутация (от лат. mutatio — изменение) — термин, употребляемый в двух смыслах: возникновение изменения в структуре генетического материала и само изменение.

Анализ возникновения мутаций и накопление мутантов в бактериальных культурах был впервые проведен в 1943 г. С. Лурия и М. Дельбрюком. Их работы заложили основы генетики бактерий.

Мутации — стойкие наследственные изменения в структуре генетического аппарата. Механизм мутаций заключается в выпадении, вставке или замене одной пары нуклеотидов либо группы нуклеотидов в молекуле ДНК, а также в изменении последовательности их расположения. Мутационной изменчивости подвержены такие признаки бактерий, как ауксотрофность по аминокислотам, пуринам, пиримидинам, витаминам и другим компонентам питательного субстрата, чувствительность, или резестентность, к антибиотикам, ферментативная активность и т. д.

Если мутантная бактериальная клетка, оказывается лучше приспособлена к условиям окружающей среды, чем исходные особи, то потомство ее при размножении культуры будет занимать все большую часть популяции и постепенно вытеснит исходные клетки. В результате произойдет изменение генотипического состава и соответственно свойств данной культуры микроорганизма.

По происхождению различают спонтанные и индуцированные мутации.

Спонтанные мутации возникают в популяциях прокариот без видимого внешнего воздействия и проявляются в самопроизвольном изменении их генома. Они носят случайный, ненаправленный характер и возникают до воздействия какого-либо селекционирующего фактора. Распространенными типами спонтанных мутаций являются устойчивость бактерий к фагам, ауксотрофность, антибиотикорезестентность. Частота спонтанных мутаций отдельных генов составляет 104 — 1011. Это значит, что любая культура бактерий, достигшая численности 104—1011 клеток, неизбежно содержит мутанты. Одной из причин возникновения спонтанных мутаций могут быть ошибки в работе. ДНК-полимеразы во время процесса репликации ДНК, например включение в синтезируемую дочернюю цепь нуклеотида, некомплементарного нуклеотиду родительской цепи (вместо аденина, комплементарного тимину, включается гуанин или цитозин). В природе спонтанные мутации служат основным источником естественной изменчивости бактерий, а следовательно, именно они и лежат в основе эволюционного процесса прокариот.

Индуцированные мутации вызывают экспериментально действием какого-либо фактора — химического соединения или различного рода излучениями (рентгеновские, ультрафиолетовые и гамма-лучи). Впервые возможность индуцирования мутаций показали в 1925 г. Г. А. Надсон и Г. С. Филиппов. Они обнаружили мутагенное действие рентгеновских лучей на клетки дрожжей.

Частота индуцированных мутаций значительно выше частоты спонтанных и зависит от природы мутагена и его дозы.

По количеству мутировавших генов и характеру изменений в первичной структуре ДНК выделяют генные и хромосомные мутации.

Генные мутации затрагивают только один ген и чаще всего являются точковыми. Последние представляют собой выпадение, вставку или замену одной пары нуклеотидов.

Хромосомные мутации распространяются на несколько генов. Они носят характер крупных перестроек в отдельных фрагментах ДНК и проявляются в виде делеции — выпадении меньшего или большего числа нуклеотидов, инверсии — повороте участка ДНК на 180°, дупликации — повторении какого-нибудь фрагмента ДНК. Нередко хромосомные мутации приводят к дезинтеграции всех систем бактериальной клетки, что сопровождается летальным эффектом.

Факторы, вызывающие мутации, получили название мутагенов. Наиболее доступным мутагеном является ультрафиолетовое облучение бактериальных культур бактерицидными лампами с длиной волны около 260 нм. При этом механизм повреждения заключается в образовании димера тимина в молекуле ДНК, что приводит к блокированию нормального процесса репликации. В зависимости от дозы ультрафиолетовое облучение может оказать на бактериальные клетки мутагенный или даже летальный эффект.

При рентгеновском и гамма-облучении в ДНК бактерии возникают различные повреждения — разрывы цепей и химические изменения нуклеотидов. Эффект повреждения прямо пропорционален дозе облучения.

Исключительной эффективностью характеризуются некоторые химические мутагены. Наиболее сильным супермутагеном является нитрозометилмочевина и родственные ей нитрозосоединения. Относительно безопасным мутагеном считается азотистая кислота НNО2. В растворе при рН 4,4 она активна по отношению ко всем группам микроорганизмов от вирусов до бактерий и грибов. Сильными мутагенами являются акридиновые красители, приводящие к мутациям типа вставок и выпадения нуклеотидов.

Эксперименты по индуцированному мутагенезу бактерий используются для решения общебиологических проблем мутагенеза, а также прикладных задач промышленной и медицинской микробиологии.

Генотипическая изменчивость прокариот наблюдается в результате рекомбинации генетического материала за счет частичного объединения геномов двух клеток и проявляется в фенотипе: бактерий. К рекомбинативной изменчивости генетического материала прокариот приводят трансформация, трансдукция и конъюгация.

В отличие от эукариот, у которых при половом процессе происходит образование истинной зиготы, объединяющей генетический материал обоих родителей, у прокариот при всех трех вышеуказанных процессах наблюдается лишь частичный перенос генетического материала из клетки-донора в клетку-реципиент, что приводит к образованию неполноценной зиготы — мерозиготы (от греч. meros — часть). Таким образом, прокариотная клетка-реципиент становится частично диплоидной, сохраняя в основном генотип клетки-реципиента и приобретая лишь отдельные свойства клетки-донора.

Ответственность за рекомбинации несут специальные гены клетки-реципиента, получившие название гес-генов. Механизм рекомбинаций включает ряд последовательных стадий: разрыв нитей ДНК клетки-реципиента; встраивание фрагментов ДНК, привнесенных из клетки-донора в геном клетки-реципиента; репликация рекомбинативной ДНК, дающей начало потомству клеток с измененным геномом. Доказательства вышеуказанного механизма рекомбинации были экспериментально получены при изучении процесса конъюгации кишечной палочки (Esсherichia coli) с использованием меченых по фосфору (Р32) клеток-доноров.

Трансформация (от лат. Transformation преобразование) — изменение генома, а следовательно, и свойств бактерий в результате переноса информации при проникновении фрагмента свободной ДНК из среды в клетку. При трансформации не требуется непосредственного контакта между клеткой-донором и клеткой-реципиентом. Источником трансформирующей ДНК может служить свежеубитая культура бактерий или чистые препараты ДНК, экстрагированной из нее.

Явление трансформации у бактерий впервые наблюдал Ф. Гриффите в 1928 г. Он обнаружил, что при совместном введении в организм мышей убитого вирулентного капсульного пневмококка 5-типа с живым авирулентным бескапсульным пневмококком К-типа все животные погибают. При этом из крови погибших мышей наряду с бескапсульными пневмококками К-типа выделяются вирулентные капсульные пневмококки 5-типа. Гриффите не сумел объяснить явление трансформации. Лишь в 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти выделили трансформирующее вещество из убитых клеток капсульных пневмококков и показали, что им является ДНК, чувствительная к ДНК-полимеразе. 64.

Рис. 5. Схематическое изображение обмена между фрагментом ДНК и хромосомой клетки-реципиента (Г. Шлегель, 1972).

Процесс трансформации проходит в несколько этапов:

• 1) адсорбция трансформирующей ДНК на поверхности компетентной клетки-реципиента;
• 2) ферментативное расщепление трансформирующей ДНК с образованием фрагментов со средней молекулярной массой (4—5) • 106;

3) проникновение фрагментов ДНК в клетку-реципиент, сопровождающееся деградацией одной из цепей ДНК и образованием одноцепочечных фрагментов;

• 4) интеграция — включение фрагментов трансформирующей ДНК в ДНК клетки-реципиента путем генетического обмена (рис. 5);
• 5) экспрессия — интенсивное размножение трансформированных клеток, потомство которых будет иметь измененный ген в молекуле ДНК.

Трансформирующий фрагмент ДНК обычно соответствует 0,3% бактериальной хромосомы, или примерно 15 генам. В клетку-реципиент проникает очень малый фрагмент ДНК, что обусловливает трансформацию только одного признака и редко двух. Путем трансформации из одной клетки в другую могут быть перенесены такие признаки бактерий, как устойчивость к лекарственным препаратам, способность к синтезу капсульных полисахаридов, ферментов, определенных метаболитов и т. д. При трансформации, как правило, не происходит добавления качественно нового наследственного признака, наблюдается лишь замена одного признака другим.

Процесс трансформации показан для многих видов бактерий — пневмококков, стафилококков, гонококков, менингококков, кишечной палочки, некоторых бацилл и клубеньковых бактерий. Изучение возможности трансформации бактерий свидетельствует о распространенности в царстве прокариот этого механизма передачи генетического материала, а следовательно, о существенной роли его в эволюционном процессе. Установлено, что проникновение фрагмента ДНК в клетку-реципиент вызывает трансформацию бактерий с достаточно высокой частотой 10−2—10−3 и зависит от вида микрoорганизма, свойств трансформирующей ДНК и состояния клеток-реципиентов.

Трансдукция заключается в переносе генетического материала из клетки-донора в клетку-реципиент умеренным бактериофагом. Явление трансдукции в 1952 г. открыли Н. Циндер и Дж. Ледерберг на примере двух штаммов сальмонелл.

Прежде чем рассмотреть суть процесса трансдукции, следует, отметить, что по механизму взаимодействия с бактериальной клеткой фаги подразделяются на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги, проникая в клетку, обусловливают формирование новых фагов и лизис бактерий. Заражение клеток умеренными фагами не всегда сопровождается лизисом бактерий, часть их выживает и становится лизогенными. В лизогенных бактериях ДНК фага включается в ДНК клетки, и умеренный фаг превращается в профаг, утрачивая при этом способность лизировать бактериальную клетку. Профаг ведет себя как часть бактериальной хромосомы и репродуцируется в ее составе в течение ряда поколений. Освобождение умеренных фагов из клеток лизогенных бактерий происходит спонтанно либо под действием индуцирующих агентов — ультрафиолетовых лучей, ионизирующей радиации и химических мутагенов.

Механизм трансдукции заключается в следующем. В процессе репродукции некоторых умеренных фагов небольшой фрагмент бактериальной хромосомы, содержащей один ген или несколько сцепленных генов, включается в геном фага. Трансдуцирующий. фаг переносит фрагмент ДНК предыдущего хозяина .в новую чувствительную к нему бактериальную клетку. Таким образом, бактериальная клетка-реципиент становится частичной зиготой.

У бактерий различают 3 типа трансдукции: специализированную, общую и абортивную.

При специализированной трансдукции в геном фага включаются строго определенные гены ДНК бактерии-донора, расположенные на хромосоме бактерии непосредственно рядом с профагом. Прилегающие к профагу гены выщепляются из бактериальной хромосомы, а часть генов профага остается в ее составе. Освобождающиеся из клетки-донора трансдуцирующие дефектные фаги вызывают лизогенизацию клетки-реципиента. ДНК дефектного фага включается в состав хромосомы клетки-реципиента, привнося в нее и гены бактерии-донора.

Общая трансдукция отличается от специализированной тем, что в состав ДНК фага включается любой фрагмент ДНК бактерии-донора.

Таким образом, при общей трансдукции трансдуцирующие фаги переносят из хромосомы бактерии-донора любые гены, контролирующие различные признаки, в клетку бактерии-реципиента.

При абортивной трансдукции фрагмент хромосомы клетки-донора, привнесенный трансдуцирующим фагом в клетку-реципиент, не включается в ее хромосому, а локализуется в цитоплазме и делении клетки-реципиента передается только одной из образующихся клеток.

Трансдукция в эксперименте показана на кишечных бактериях, псевдомонадах, стафилококках, бациллах и актиномицетах. Очевидно, в естественных условиях перенос генетического материала с помощью фагов может быть самым распространенным механизмом рекомбинации у прокариот. Трансдукция определяет появление разновидностей бактерий с новыми свойствами, устойчивость к лекарственным препаратам, синтез ферментов, аминокислот и др.

В экспериментах по генной инженерии трансдукция открывает не только широкие возможности межвидовой гибридизации бактерий, но и возможность получения гибридов среди таксономически отдаленных групп прокариот.

Конъюгация происходит при непосредственном контакте бактериальных клеток и предусматривает направленный перенос генетического материала из клетки-донора в клетку-реципиент. Феномен конъюгации в 1946 г. описали Дж. Ледерберг и Э. Тейтум на примере кишечной палочки штамма К12.

Способность бактерий к конъюгации связана с наличием у них полового F-фактора, относящегося к числу конъюгативных плазмид. Клетки, несущие F-фактор, обозначаются F+; клетки, лишенные F-фактора, — F-. F-фактор (F-плазмида) в клетках F+ обычно находится в изолированном состоянии от бактериальной хромосомы и является цитоплазматической структурой. Бактериальные клетки, содержащие F-фактор, отличаются от остальных клеток рядом свойств: измененным поверхностным зарядом и способностью синтезировать дополнительные поверхностные структуры F-пили.

Процесс конъюгации начинается с прикрепления конца F-пили клетки-донора к клетке-реципиенту. В течение нескольких минут клетка-донор и клетка-реципиент сближаются, возможно, за счет сокращения F-пили и вступают в непосредственный контакт. Через цитоплазматический мостик по каналу сокращенной F-пили, менее чем за 5 мин, происходит передача полового F-фактора, независимо от бактериальной хромосомы, из цитоплазмы клетки-донора F+ в цитоплазму клетки-реципиента F-. При этом клетка-донор не теряет своей донорной способности, так как в ней остаются копии F-фактора (рис. 19).

Среди популяции клеток F+ имеются бактерии, способные при конъюгации передавать не F-фактор, а фрагмент бактериальной хромосомы. Эти клетки бактерий и образованные ими штаммы обозначаются Hfr (от англ. high frequency of recombination), что означает бактерии с высокой частотой рекомбинации. Рекомбинации между клетками Нfг и клетками Fпроисходят в тысячу раз чаще, чем между клетками F+ и F-. Отличие клеток Hfr от клеток F заключается в том, что половой F-фактор у них включен в бактериальную хромосому. Во время конъюгации в клетке-Доноре Hfr идет процесс репликации ДНК;

При этом одна из реплицирующихся цепей ДНК через конъюгационный мостик проникает в клетку-реципиент F, вторая остается в клетке-доноре Hfr, затем каждая из этих цепей достраивается комплементарной нитью. Конъюгационный мостик непрочен, он легко разрывается, поэтому из клетки-донора Hfr в клетку-реципиент F? передается не вся хромосома, а лишь ее фрагмент. Между перенесенным из клетки Hfr фрагментом хромосомы и гомологичным участком хромосомы клетки F? происходит генетический обмен. В результате часть донорной ДНК встраивается в ДНК реципиента, а соответствующая часть реципиентной ДНК исключается из нее. Эффективность включения донорной ДНК в хромосому реципиента высока и составляет примерно 0,5 (рис. 5). Конъюгацию прокариот не следует отождествлять с половым процессом эукариот, так как при конъюгации в клетку р. передается только часть генетического материала клетки F+, в результате чего образуется неполноценная мерозигота. Основу последней составляет геном клетки-реципиента с привнесенной частью генома клетки-донора.

Скачком в эволюции прокариот явилось появление рекомбинативной изменчивости, заключающейся в частичном объединении генетической информации двух прокариотных клеток донора и реципиента. Таким образом возник новый дополнительный материал для естественного отбора, ускоряющий процесс эволюции. Из трех вышерассмотренных рекомбинативных процессов наиболее совершенным является конъюгация, так как она обеспечивает более полный обмен генетической информации между двумя клетками. Известны случаи, когда при длительной конъюгации (90 мин) двух клеток Escherichia coli наблюдается вхождение всей хромосомы клетки-донора в клетку-реципиент.

Однако, оценивая значимость рекомбинаций в эволюционном процессе прокариот, следует иметь в виду, что эффективность генетических рекомбинаций оказывается высокой только для близкородственных бактерий имеющих родство в пределах вида.