Принципы и методы диагностики хромосомных болезней

В настоящее время разработаны надежные и эффективные методы хромосомного анализа клеток плода и зародышевых оболочек.

В зависимости от срока беременности и задач исследования материалом для хромосомного анализа могут служить клетки амниотической жидкости, хориона, плаценты и лимфоциты пуповинной крови плода, полученные тем или иным инвазивным методом.

Инвазивный (оперативный) методы — это внутриматочные вмешательства под ультразвуковым контролем, выполняемые с целью получения плодного материала, для последующих гистологических, биохимических, цитогенетических или молекулярных анализов (рис. 20).

Методы ЭКО:

• § Преконцепционная диагностика (полярные тельца)
• § Доимплантационная диагностика (бластомеры или трофобласт)

I триместр беременности

(период органогенеза).

Хорионбиопсия:

• § Трансцервикальный способ (7−12-я недели)
• § Трансабдоминальный способ (с 9/10-й недели)

II триместр беременности

(плодный период).

Плацентобиопсия:

• § Цитогенетическая диагностика — до 22-й недели
• § Молекулярная диагностика — до 26-й недели

Амниоцентез (с 13/14-й недели).

Кордоцентез (с 19/20-й недели) Характеристика методов получения препаратов хромосом для стандартного кариотипирования плода, их преимущества и недостатки представлены в таблице 5.

Таблица 5

Методы получения препаратов хромосом для стандартного кариотипирования плода.

Цитогенетический анализ клеток плодного происхождения.

Клетки амниотической жидкости (КАЖ) представлены несколькими типами различного происхождения:

ь Клетки амниотической оболочки (собственно амниоциты);

ь Эпителиальные клетки плода (эпидермиса, пищеварительного тракта, мочеполовых и дыхательных путей, слизистой ротовой полости).

Количественный и качественный состав КАЖ, а также концентрация жизнеспособных клеток имеют индивидуальную вариабельность и зависят от стадии развития. Оптимальными для пренатальной диагностики являются амниоциты, которые обычно пролиферируют и являются специфическими для данной культуры.

Стандартное культивирование амниоцитов с момента получения образца АЖ до кариотипирования занимает 14−21 день.

Клетки ворсин хориона имеют различное происхождение:

ь Клетки цитотрофобласта (дифференцируются на стадии морулы) ь Клетки мезенхины (дифференцируются на стадии бластоцисты).

Для хромосомного анализа по клеткам хориона или плаценты используют два основных метода.

• 1. Длительное культивирование
• 2. «Прямые» препараты.

Лимфоциты пуповинной крови плода. Для хромосомного анализа крови плода используют стандартную методику стимулирования лимфоцитов фитогемагглютинином. Этот метод дает наиболее адекватное представление о хромосомном статусе плода и рекомендуется для кариотипирования плода в случае хромосомного мозаицизма в плаценте, а также при наличии пороков развития не только во втором, но и в третьем триместре беременности.

В настоящее время известно несколько способов окрашивания хромосом, основными среди которых являются G-, Q-, R-, Cметоды. При G — методе окрашивания (G-banding) каждая хромосома имеет специфическую последовательность темных и светлых полос. Данный тип окрашивания получается при воздействии на хромосомные препараты таких агентов как щелочи, протеолитические ферменты, солевые растворы и т. д. Окрашенные G-методом препараты можно анализировать под световым микроскопом. Этот метод сравнительно прост, не требует специальной оптики и широко используется в клинической практике. Получить Q — окрашивание (Q-banding) можно при использовании специальных флюоресцентных красителей, таких как акрихин, акрихин иприт и т. д. При этом, для каждой хромосомы получают специфическую последовательность яркои тускло-флюоресцирующих полос. Исчерченность при Qи Gокрасках почти всегда совпадает. При Q-методе требуется специальная флюоресцентная оптика для анализа хромосомных препаратов. При R-дифференциальном окрашивании получается обратная G-banding картина, т. е. полосы, окрашенные при G-способе, не окрашиваются и наоборот. R-метод, единственное преимущество которого состоит в четко прокрашенных теломерных участках, трудно воспроизводим. C — метод (C-banding) — специфическое окрашивание околоцентромерного гетерохроматина. С помощью этого метода окрашиваются прицентромерные районы хромосом (в основном, крупные блоки гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16, часто также хромосом 13, 14, 15 и 21, 22) и дистальная часть хромосомы Y. В дополнение к основным методам существует метод высокоразрешающего окрашивания, при котором большую исчерченность обеспечивали исследования хромосом на различных стадиях клеточного цикла, т. е. в профазе или прометафазе (вышеописанные методы предполагают исследование клеток в метафазе митоза) с использованием приемов, влияющих на конденсацию хромосом. При этом, как было отмечено выше, наблюдают большее число полос на каждой хромосоме отдельно и в кариотипе в целом. Разработка генно-инженерных технологий и их применение в исследованиях генома человека вывело изучение тонкой организации хромосом на новый этап. Появление в начале 90-х годов прошлого века молекулярно-цитогенетических методов и методов ДНК-анализа открыло в изучении хромосом человека и их нарушений новое измерение — субмикроскопический уровень. Именно с их помощью проблема объективной диагностики широкого спектра хромосомной патологии была подведена к разрешению.

Проектное задание

• 1. На приеме у врача-генетика беременная женщина 31 года, обеспокоенная тем, что ее сестра недавно родила дочь с синдромом Дауна. Опишите рекомендации врача-генетика. Ответ аргументируйте.
• 2. При генетическом консультировании у женщины обнаружена одна перестройка, захватывающая хромосомы 2 и 3.
• А) Как называется эта перестройка?
• Б) Нарисуйте схему синапсиса этих хромосом в мейозе, отметив все выделенные фрагменты хромосом.
• В) Фенотип этой женщины в норме, почему?
• Г) У женщины в анамнезе два невынашивания беременности. Объяснимо ли это с точки зрения генетики?

Можно ли ей рекомендовать попытаться забеременеть еще раз?

Какова вероятность рождения у нее нормального ребенка?

• 3. Супружеская пара нуждается в генетическом консультировании, поскольку со стороны мужа в трех поколениях имелись мертворожденные и несколько детей умерли вскоре после рождения из-за врожденных дефектов. Оказалось, что в кариотипе мужа 46 хромосом, однако при дифференциальной окраске хромосом выяснилось, что хромосома 1 содержит протяженную инверсию (70% всей длины). Гомолог хромосомы 1 и все другие хромосомы в норме.
• А) Объясните причину высокой эмбриональной смертности в родословной мужа.
• Б) Какова вероятность рождения нормальных детей и детей с аномалиями у этих супругов?
• В) Можно ли советовать жене вынашивать каждую беременность, чтобы определить нормальный них ребенок или нет, или же есть другие способы диагностики?

Тесты рубежного контроля

• 1. Пренатальная диагностика:
  • А) комплекс мероприятий, направленных на предупреждение развития заболевания у ребенка
  • Б) мероприятия по предотвращению беременности при высоком риске рождения больного ребенка
  • В) диагностика болезни у эмбриона или плода
  • Г) оценка риска развития заболевания у будущего ребенка
• 2. Показаниями для пренатального цитогенетического исследования являются:
  • А) возраст матери 39 лет
  • Б) в анамнезе рождение ребенка с синдромом Дауна
  • В) наличие у троюродного брата расщелины губы и неба
  • Г) робертсоновская транслокация у отца
• 3. Укажите неинвазивные методы пренатальной диагностики:
  • А) фетоскопия
  • Б) УЗИ
  • В) хорионбиопсия
  • Г) анализ ХГЧ в сыворотке беременной
• 4. Укажите инвазивные методы пренатальной диагностики:
  • А) кордоцентез
  • Б) УЗИ
  • В) анализ АФП и ХГЧ в сыворотке беременной
  • Г) биопсия ворсин хориона
• 5. Укажите оптимальные сроки проведения биопсии хориона:
  • А) 10−12 недель
  • Б) 4−6 недели
  • В) 7−9 недель
  • Г) 22−25 недели
• 6. Укажите оптимальные сроки проведения кордоцентеза:
  • А) 10−12 недель
  • Б) 5−8 недели
  • В) 7−9 недель
  • Г) 20−22 недели
• 7. Кордоцентез проводят при повышенном риске по:
  • А) хромосомным синдромам, обусловленным структурными мутациями
  • Б) наследственным болезням крови
  • В) порокам развития
  • Г) хромосомным синдромам, обусловленным числовыми мутациями
• 8. По результатам УЗИ (множественные аномалии) женщине 27 лет был проведен амниоцентез на 16 неделе беременности. При цитогенетическом исследовании у плода выявили трисомию 21. Какова должна быть тактика врача-генетика?
• А) рекомендовать прерывание беременности
• Б) предоставить семье полную информацию о вероятном состоянии здоровья ребенка, возможностях его лечения и социальной адаптации
• В) рекомендовать повторную беременность
• Г) предоставить право окончательного решения о пролонгировании или прерывании беременности родителям
• 9. Объектом исследования при проведении кордоцентеза являются:
  • А) ворсины хориона
  • Б) пуповинная кровь плода
  • В) клетки плаценты
  • Г) венозная кровь матери
• 10. Ошибки при определении кариотипа плода могут быть связаны:
  • А) с клональным характером роста клеток амниотической жидкости
  • Б) с мозаицизмом клеток плода
  • В) с физиологической полиплоидией культивируемых клеток
  • Г) с загрязнением образцов вод клетками материнского происхождения
  • Д) со всеми перечисленными причинами