Выделение нейтрофилов из периферической крови и подготовка образцов

Образцы периферической крови доноров получали при условии информированного добровольного согласия доноров, в соответствии с основными этическими принципами проведения медицинских исследований, изложенными в Хельсинской декларации. В корреляционный анализ были включены данные от 65 добровольцев обоих полов. Группу молодых составили 26 доноров в возрасте от 20 до 59 лет (медиана 30.5 лет, 13 мужчин, 13 женщин); группу пожилых доноров составили 24 добровольца в возрасте 60−89 лет (медиана 73.5 года, 9 мужчин, 15 женщин); в группу долгожителей вошло 15 доноров в возрасте 90 лет и старше (медиана 91 год,.

7 мужчин, 8 женщин), наблюдающихся в Российском геронтологическом научно-клиническом центре. Критериями включения добровольцев в исследование являлись отсутствие у них патологии в активной фазе (острые инфекции, опухоль, инсульт, инфаркт), лечения кортикостероидами или нестероидными противовоспалительными средствами, способность самообслуживания.

Периферическую кровь собирали закрытым способом в стерильные пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта гепарин (Vacutube, Италия). Начало выделения клеток производили не позднее двух часов после забора крови. Процедуру выделения нейтрофилов проводили по методике градиентного разделения клеток с использованием коммерческой среды Polymorphprep. Цельную кровь наслаивали на среду в соотношении 1:1, затем проводили центрифугирование в течение 30 мин при 500 g и 23 °C в режиме без торможения. Собирали нижнюю интерфазу, соответствующую популяции полиморфноядерных лейкоцитов (нейтрофилов), с последующей двукратной отмывкой при 400 g в течение 15 мин в DPBS, или, в случае измерения внутриклеточных АФК, в растворе Хэнкса. После процедуры отмывки нейтрофилы переводили в среду RPMI-1640, содержащую 2 мМ Lглутамина, с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки, 15 mM HEPES (полная среда). В этой среде проводили все последующие манипуляции с клетками. Жизнеспособность клеток проверяли с помощью окрашивания трипановым синим (она составляла, как правило, более 95%). Готовили образцы, содержащие по 500 мкл клеточной суспензии с концентрацией 2Ч106 клеток/мл. Часть образцов подвергали нагреванию на термостатируемой водяной бане (BioSan, Латвия). Контрольные образцы, а также образцы подвергнутые тепловому шоку (далее ТШ) до момента окрашивания антителами инкубировали необходимый период времени (5 мин, 30 мин, 60 мин и т. д.) в условиях повышенной влажности, при температуре 37 °C в атмосфере с 5% СО2.

В ряде экспериментов перед ТШ проводили предварительную инкубацию нейтрофилов с глибенкламидом (0.5 мМ, 2 ч), хлоридом аммония (50 мМ, 2 ч) либо циклогексимидом (100 мкМ, 30 мин).