Материал и методы исследований

Материалом для исследований послужили сорта яблони Апорт АСС, Память Есаулу, Щит, а также сорта Голден Делишес и Флорина и их клоновые формы — Золотая Корона и Фламенко, соответственно.

Для экстракции ДНК использовали метода ЦТАБ, основанный на применении цетилтриметиламмоний бромида в качестве основного детергента в составе лизирующего буфера [9].

Изучали полиморфизм восьми SSR-локусов: CH01g12, CH03a04, CH01f03b, CN581493, AJ 320 188, Hi04d02, Hi03с04, CH02a04. Постановку ПЦР проводили по следующей программе: 5 минут при 94^оС — начальная денатурация, следующих 30 циклов: 30 секунд денатурация при 94 ^оС, 30 секунд отжиг праймеров при 58 ^оС, 30 секунд синтез при 72^оС; последний цикл синтеза — 3 минуты при 72С^о.

В состав ПЦР смеси входили: 40−50 нг ДНК, 0,05 мМ dNTPs, 0,3M каждого праймера, 1 единица Taq-полимеразы, 25 mM KCI, 60 mM Tris-HCI, pH 8,5, 0,1% Тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1,5 мМ MgCI2, в общем объеме реакционной смеси 25мкл. Реакция была проведена в амплификаторе Eppendorf Mastercycler gradient.

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали 8% акриламидный гель на основе 1ЧТрис-боратного буфера (0,09 М Трис, 0,09 М Борной кислоты, 2 мМ ЭДТА, рН=8,2). Электрофорез проводили при напряжении 200V в течение 3 часов. Гелевые пластины окрашивали в раствор бромистого этидия 5мкг/мл и фотографировали в ультрафиолете.

Для определения относительной молекулярной массы амплифицированных фрагментов использовали программу Gel-Pro Analyzer 3.1.

Несмотря на то, что используемые микросателлитные ДНК — маркеры ранее были нами использованы в сортовой идентификации яблони [10] и проявили уровень полиморфизма, достаточный для дифференциации сортов и подвоев, в данное исследование было включено дополнительно три сорта местной селекции: Апорт, Память Есаулу, Щит помимо сортов Голден Делишес и Флорина и их клоновых форм. Это было сделано для более объективной сравнительной оценки уровня полиморфизма изучаемых SSR-маркеров выявляемого при оценке межсортового полиморфизма и полиморфизма сорт/клон сорта.

Следует отметить, что все используемые в работе ДНК-маркеры проявили высокий уровень межсортового полиморфизма — от трех до пяти аллелей на локус в изучаемой выборке из пяти сортов. Результаты микросателлитного генотипирования сортов представлены в таблице 1. Наличие двух фрагментов, разделенных косой чертой, говорит о гетерозиготности локусов.

Таблица 1 — Полиморфизм микросателлитных локусов у изученных сортов яблони*.

* - размер ПЦР фрагмента указан в парах нуклеотидов Из результатов микросателлитного генотипирования видно, что каждый из сортов обладает уникальным, специфичным лишь для него набором аллелей по изученным восьми микросателлитным локусам. Это подтверждает высокий уровень полиморфизма SSR — локусов, использованных в работе.

На рисунках 1−3 продемонстрированы результаты электрофоретического разделения продуктов амплификации с праймерными парами, фланкирующими SSR-локусы, изученные в ходе выполнения исследований.

На электрофореграммах, наряду с сортами яблони, вовлеченными в исследование, представлены также и клоновые формы сортов Голден Делишес и Флорина. Для сорта Голден Делишес было изучено шесть клоновых форм (Золотая корона), для сорта Флорина — три формы (Фламенко). Кроме того, с целью определения генетической чистоты образцов сорта Апорт, изучали полиморфизм SSR-локусов у двух различных образцов: Апорт АСС 68−32 и Апорт АСС 68−2.

MВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MВ Рисунок 1. Результаты анализа изученных образцов яблони по микросателлитному локусу CH01f03b.

МВ — маркер молекулярного веса ДНК (pBR322/BsuR1); 1−16 сорта и формы яблони: 1 — Апорт АСС 68−2, 2 — Апорт АСС 68−32, 3 — Память Есаулу, 4 — Щит, 5 — Фламенко 64−32, 6 — Фламенко 64−27, 7 — Фламенко 64-II-24, 8 — Флорина, 9 — Золотая Корона 64−16, 10 — Золотая Корона 64-II-18, 11 — Золотая Корона 64-II-36, 12 — Золотая Корона 64−1, 13 — Золотая Корона 64−7, 14 — Золотая корона 64−8, 15 — Голден Делишес.

1 MВ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MВ Рисунок 2. Результаты анализа изученных образцов яблони по микросателлитному локусу Hi03C04.

МВ — маркер молекулярного веса ДНК (pBR322/BsuR1); 1−16 сорта и формы яблони: 1 — Апорт АСС 68−2, 2 — Апорт АСС 68−32, 3 — Память Есаулу, 4 Флорина, 5 — Фламенко 64−32, 6 — Фламенко 64−27, 7 — Фламенко 64-II-24, 8 -Щит, 9 — Золотая Корона 64−16, 10 — Золотая Корона 64-II-18, 11 — Золотая Корона 64-II-36, 12 — Золотая Корона 64−1, 13 — Золотая Корона 64−7, 14 — Золотая корона 64−8, 15 — Голден Делишес.

MВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MВ Рисунок 3. Результаты анализа изученных образцов яблони по микросателлитному локусу AJ 320 188 SSR.

МВ — маркер молекулярного веса ДНК (pBR322/BsuR1); 1−16 сорта и формы яблони: 1 — Голден Делишес, 2 — Золотая Корона 64−16, 3 — Золотая Корона 64-II-18, 4 — Золотая Корона 64-II-36, 5 — Золотая Корона 64−1, 6 — Золотая Корона 64−7, 7 — Золотая корона 64−8, 8 — Щит, 9 — Флорина, 10 — Фламенко 64−32, 11 — Фламенко 64−27, 12 — Фламенко 64-II-24, 13 — Память Есаулу, 14 — Апорт АСС 68−2, 15 — Апорт АСС 68−32.

Из результатов электрофоретического анализа продуктов ПЦР с праймерными парами, фланкирующие микросателлитные локусы, видно, что межсортовой полиморфизм может быть четко идентифицирован. К примеру, по микросателлитному локусу AJ 320 188 SSR, все сорта отличаются друг от друга по размеру амплифицированных фрагментов (1-Голден Делишес, 8-Щит, 9-Флорина, 13-Память Есаулу, 14,15- Апорт АСС). Это выражено в наличии электрофоретических фрагментов на разных позициях на электрофореграмме.

Несмотря на высокий уровень межсортового полиморфизма, при сравнительной оценке результатов SSR—анализа полиморфизма на уровне сорт/клон сорта было выявлено, что сорта Голден Делишес и Флорина имеют идентичные микросателлитные ДНК — фингерпринты с их клоновыми формами. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 — Полиморфизм микросателлитных локусов между сортами яблони Голден Делишес и Флорина и их клонами.

Как видно из таблицы, все изученные микросателлитные ДНК-маркеры не позволили идентифицировать генетические различия на уровне сорт/клон сорта.

Все клоновые формы имеют ПЦР — фрагменты идентичные по размеру с сортом, из которого были выделены. Это свидетельствует о необходимости значительного увеличения количества SSR-маркеров, используемых для клоновой идентификации.

Наряду с микросателлитными маркерами, перспективным может оказаться использование других типов ДНК-маркеров, в том числе и мультилокусных. Независимо от типа ДНК-маркеров очевидна необходимость вовлечения в исследование большего количества ДНК-маркеров, в сравнении с сортовой идентификацией.