Принципы проточной цитофлюориметрии

В основе проточной цитофлюориметрии лежит проведение фотометрических флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света. Фотометрические каналы используются для оценки размеров клеток и внеклеточных структур. Частицы, отличающиеся по размерам, по-разному рассеивают свет, при этом характер рассеивания зависит от соотношения длины волны света и диаметра частиц. Если размер частиц меньше длины облучающего монохроматического света лазера (например, внутриклеточные структуры), то существенное количество света рассеивается под углом 90° (боковое светорассеяние). В том случае, когда длина волны облучения сопоставима с размерами рассеивающихся частиц, характер рассеивания меняется. Световая волна как бы огибает частицу, взаимодействует с ней и отклоняется от прямолинейного распространения на небольшой угол — малоугловое или прямое светорассеяние. Такой тип рассеивания возникает взаимодействии света с поверхностью клеток разного размера. При одновременной регистрации бокового и прямого светорассеяния возможно выделить все клеточные популяции лейкоцитов. В этом случае удается определить физические свойства любой неокрашенной клетки (размер, гранулярность) и, таким образом, разделить анализируемую клеточную популяцию отдельные субпопуляции (например, лейкоциты периферической крови лимфоциты, моноциты и гранулоциты).

Флюоресцентный канал применяется для изучения клеточных маркеров, для чего используются МАТ, меченные различными флюорохромными красителями к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток (белкам, ДНК, РНК). После окрашивания клеток МАТ происходит специфическое связывание последних с клеточными структурами и регистрация флюоресценции, индуцированной излучением лазера. Техника регистрации флюоресценции состоит в следующем. При облучении клеток длиной волны, возбуждающей флюорохром, происходит поглощение света. Затем флюорохром испускает свет, но уже меньшей интенсивности (большей длины волны), чем поглощенный. Кроме того, флюорохром испускает свет во все стороны, поэтому флюоресценцию можно регистрировать под любым углом по отношению к облучаемому свету. Как правило, регистрацию проводят под прямым углом, однако для монохроматического лазерного облучения это не является обязательным условием, так как испускаемый флюоресцентный свет всегда имеет большую длину волны, чем возбуждающий свет лазерного облучения [4].

Материалом для иммунофенотипирования могут служить стабилизированные периферическая кровь (кровь необходимо брать натощак с 8 до 10 часов утра) и костный мозг, ликвор, выпотные жидкости и клеточные суспензии различных тканей (лимфатические узлы, селезенка и др.). В качестве антикоагулянта используются гепарин (50 U/ml) или калиевые соли ЭДТА (К₂ или К₃ЭДТА в концентрации 1,6−2,2 мг/мл). Выбор антикоагулянта определяется тактикой исследования. Стабилизированные гепарином кровь или костный мозг могут храниться более длительный срок (в течение 3 дней) и использоваться для дополнительного цитогенетического исследования.

Следует помнить, что кровь, стабилизированная гепарином, не пригодна для подсчета клеток в гематологических анализаторах и морфологического исследования.

Преимущества использования в качестве антикоагулянта ЭДТА:

меньшая потеря миелоидных клеток вследствие снижения адгезии их к стенкам пробирки;

снижение агрегации тромбоцитов, агрегаты которых затрудняют вы деление гейта бластных клеток небольшого размера;

материал может быть использован для подсчета клеток в гематологическом анализаторе и морфологического исследования.

При применении в качестве антикоагулянта К-ЭДТА образцы крови или костного мозга пригодны для цитометрического исследования в течение 24 часов от момента взятия материала. При более длительном хранении образца необходимо оценить жизнеспособность клеток. В случае определения менее 80% жизнеспособных клеток материал не подлежит исследованию, так как возможна потеря антигенов, особенно слабо экспрессированных на клеточной поверхности.

Взятие плевральной, асцитической, перикардиальной, спинномозговой и других жидкостей осуществляется в контейнер с забуференным физиологическим раствором или средой RPMI без добавления антикоагулянта [4].

Принцип метода Суспензия предварительно окра-шенных флюоресцирующими краси-телями клеток помещается в контейнер для проб проточного цитометра. Через наконечник специальной конструкции под давлением клеточная суспензия впрыскивается в центр быстро движущегося в том же направлении потока жидкости. Клетки, подхваченные потоком жидкости, выстраиваются друг за другом, образуя «цепочку» — принцип гидродинамического фокусирования, благодаря которому создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обтекающей жидкостью.

Измерения происходят в проточной кювете прибора при пересечении клеткой луча аргонового лазера, охлаждаемого воздухом (мощность 25 мВт, длина волны 488 нм), где молекулы флюоресцентных красителей, связанные с клетками, переходят в возбужденное состояние. Возвращаясь через короткое время в исходное состояние, молекулы испускают кванты света с иными длинами волн. Это вторичное излучение, имеющее строго определенную для каждого флюорохрома длину волны, проходя через оптическую систему прибора (линзы, фильтры, двухцветные зеркала), регистрируется высокочувствительными детекторами (фотоэлектронными умножителями), преобразующими его в электрические сигналы, поддающиеся компьютерной обработке. Проточные цитофлюориметры могут быть оборудованы одним, двумя или более лазерами. В случае использования двух или более лазеров в исследования могут быть включены флюорохромы, возбуждаемые на разных длинах волн (488 нм, 635 нм, 407 нм и др.).

Иммуноцитофлюориметрический анализ клеток производится по пяти основным параметрам:

две характеристики светорассеяния клеток: FSC (forward side scatter) — показатель прямого светорассеяния и ортогональный SSC (90°) (side scatter) — показатель бокового светорассеяния;

три канала детекции специфического флюоресцентного сигнала красителя на разной длине волны.

Как уже было сказано выше, канал прямого светорассеяния (FSC-канал) используется для регистрации рассеивания света от поверхности клеток под малыми углами (1−10°), что позволяет определять их размеры. Канал бокового светорассеяния (SSC-канал) позволяет регистрировать рассеиваемые клеточными структурами лучи под углами до 90°. Отражение лазерных лучей происходит как от поверхности ядер клеток, так и от различных внутриклеточных структур. Этот параметр отражает оптическую плотность цитоплазмы клеток, характер клеточных включений и гранулярность клетки.

Термин «гранулярность» имеет специфическую цитофлюориметрическую нагрузку и не является отражением морфологического понятия «гранулярности или зернистости». Под понятием «гранулярность», которую отражает параметр SSC, следует понимать всю совокупность образований, формирующих клетку, включая любые клеточные органеллы и ядро. Использование этого параметра позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы, а также о неоднородности гранулярности цитоплазмы.

Анализ информации, получаемой прибором по каналам светорассеяния, дает возможность разделить лейкоциты периферической крови на три популяции — лимфоциты, моноциты и гранулоциты. Лимфоциты характеризуются наименьшими размерами, наиболее крупные — гранулоциты, моноциты занимают промежуточное положение по параметрам FSC. Наиболее низкие характеристики SSC имеют лимфоциты, промежуточные — моноциты и высокие показатели SSC — у гранулоцитов.

Параметры светорассеяния позволяют произвести анализ в определенном гейте — клеточной популяции с заданными характеристиками («регион интересoв»). При добавлении к клеточной суспензии МАТ, конъюгированных с флюорохромами, происходит связывание клеток, возбуждение флюоресценции и последующая ее регистрация при длине волны 488 нм (рис. 6).

Использование нескольких флюоресцентных меток позволяет проводить одновременный двух-, трехцветный и более анализ, так как каждый флюорохром при прохождении через луч лазера испускает свет различной длины волны. Наиболее часто в качестве красящей метки применяется флюоресцеинизотиоционат (FITC), который улавливается FL-1-детектором (зеленый спектр), фикоэритрин (РЕ) — FL-2-детектором (красный спектр), менее часто — тандем цианин-5/фикоэритрин и пиридин хлорофилл (PerCp, Су5/РЕ) — FL-3-детектором и аллофикоцианин (АРС) — FL-4-детектором. Номер канала зависит от конструкции используемого прибора. При воздействии лазерным лучом флюоресцентные красители, входящие в состав реагентов, генерируют различные цвета, что позволяет определять два и более антигена одновременно. С этой целью современные модели приборов могут быть оснащены двумя или более лазерами и четырьмя или более фотоумножителями, что позволяет регистрировать различные флюорохромы на разных длинах волн. При выборе сочетаний флюорохромов для одновременного определения нескольких клеточных маркеров следует учитывать длину волны источника света и способность оптической системы прибора разделять и одновременно регистрировать сигналы от используемых флюорохромов.

В проточном цитофлюориметре свет преобразуется в электрические сигналы, которые обрабатываются, и в конечном итоге определяется количественная величина каждого измеряемого параметра. Эти величины дискретизируются и передаются в компьютер для вывода на дисплей и анализа. Использование многоцветного проточноцитометрического исследования позволяет одновременно получить информацию о нескольких антигенах на поверхности клеток [4].