Методы количественного определения сапонинов в лекарственном растительном сырье

Для количественного определения сапонинов в растительном сырье применяют методы, основанные на использовании биологических (гемолитический, рыбный индекс), физических (пенное число) и химических (содержание анализируемых веществ) свойств сапонинов Весовой метод. Основан на осаждении сапонинов с последующим взвешиванием осадка Иногда для сырья, содержащего сапонины (при научных исследованиях) определяют пенное число и гемолитический индекс.

Пенное число — наименьшая концентрация извлечения из 1 г сырья, при встряхивании которого в течение 15 сек образуется устойчивая в течение 15 мин пена. Основан на физических свойствах сапонинов[9].

3. Гемолитический индекс — наименьшая концентрация извлечения из 1 г сырья или раствора чистого сапонина, которая вызывает гемолиз эритроцитов, содержащихся в 1 мл 2% раствора дефибринированной крови барана. Извлечение сапонинов и разведение проводят изотоническим раствором. Готовится серия разведений и определяется наименьшая концентрация. При работе с кровью других животных параллельно ставят контроль со стандартным сапонином (0,02% раствор дигитонина). Результаты выражают соотношением массы сырья (1 г) и разведения. Например 1:5000, 1:20 000 и т. д.

Эти методы не дают представления о количественном (%) содержании сапонинов, а свидетельствуют о поверхностной или гемолитической активности[9].

4. Методы определения рыбного индекса.

Рыбный индекснаименьшая концентрация извлечения, при которой гибнут рыбы массой до 0,5 г и длиной 3−4 см в течение 1 ч.

• 5. Фотоколориметрический метод. Основан на определении по окрашенным соединениям (определение суммы фуростаноловых гликозидов в сырье пажитника и диоскореи). Полученный при этом окрашенный комплекс (окраска от розовой до малиновой) имеет максимум поглощения при длине волны 518 нм. 9]
• 6. Титрометрический метод анализа-для сапонинов, имеющих свободную карбоксильную группу (сапонины солодки, аралии). При этом используют потенциометрическое титрование.
• 7. Спектрофотометрический метод анализа. Используется в случае сапонинов, поглощающих в УФ-области. Например, глицириновая кислота имеет максимум поглощения при длине волны 258 нм, что нашло отражение в методике количественного определения данного вещества в фармакопейной статье «Корни солодки» (ГФ СССР Х издания). Данный метод основан на осаждении глицирризиновой кислоты из кислого ацетонового извлечения 25% раствором аммиака с последующим спектрофотометрическим определением[9].
• 8. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является наиболее перспективным методом, с точки зрения качественного и количественного анализов, однако она пока не используется в отечественной НД на сырье. сапонины стероидный лекарственный

В настоящее время первые четыре метода практически не используется в НД для анализа сырья и большей мере актуальны при проведении поисковых исследований сырья, содержащего сапонины.

В действующей НД для определения подлинности сырья используют, как правило химические и физико-химические методы (чаще всего в ТСХ), а для количественного определения сапонинов-фотоколориметрический, спектрофотометрический и титрометрический методы анализа[9].

При выяснении структуры сапонинов помимо традиционных методов (элементарный анализ, определение молекулярной массы) широко используются методы УФ-спектроскопии, ИК-спектроскопии, Ямр-спектроскопии.

ИКспектроскопия при исследовании тритерпенов применяется для обнаружения и характеристики двойных связей, гидроксильных групп, О-ацильных группировок, карбонильных, карбоксильных, метильных групп.

По характерным полосам поглощения CH₃-групп в области 1245−1392 см^-1 отличают тетрациклические тритерпены от пентациклических групп альфаи бетаамирина, а также последние друг от друга. По ИК спектрам продуктов окисления оксидом рутения (1У) предложен метод доказательства положения изолированной двойной связи в тритерпенах[9].

Строгое отнесение сапонинов к сткроидам может быть сделано на основании ИК спектров и их генинов: наличие полос поглощения при 852(866), 900 (900), 922(922), 987 (982) см^-1 (спирокетальная группировка нормального и изо-(рядов) позволяет однозначно отнести сапонины к стероидному ряду.

В последнее время при исследовании структур пентациклических тритерпенов получила распространение масс-спектрометрия и методы ЯМР спектроскопии.

Установление строения углеводного остатка тритерпеновых и стероидных сапонинов осуществляется с помощью методов структурной химии олигои полисахаридов [9].

Сюда входит:

• -определение качественного и количественного состава моносахаридов;
• -установление последовательности моносахаридных остатков в углеводной цепи;
• -определение положения гликозидных связей в моносахаридных остатках;
• -определение размеров оксидных циклов моносахаридов;
• -установление конфигурации гликозидных центров[9].