Обсуждение результатов исследования

Длительно незаживающие раны и трофические язвы являются распространенным заболеванием. Отмечается увеличение числа больных с данной патологией. Большинство из них неоднократно лечилось в условиях стационара и в амбулаторном режиме. Значительное число способов лечения длительно незаживающих ран и трофических язв нижних конечностей свидетельствуют о том, что в настоящее время не существует эффективного способа лечения, позволяющего получить стойкий положительный результат. Причиной стойкого хронического воспаления в длительно незаживающей ране является первичная или вторичная иммунодепрессия. Функциональная неполноценность макрофагальных клеток не может ликвидировать патоген, а медиаторы воспаления распадающихся клеток продолжают поддерживать хроническое воспаление длительное время. Применяемые способы лечения не позволяют разорвать круг хронического воспаления. Все это обуславливает актуальность поиска новых методов лечения больных с данной патологией.

Целью работы явилось изучение новых технологий: трансплантации культур клеток кожи и цитокинов в лечении больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами.

Для достижения цели настоящего исследования были созданы методы лечения больных с длительно незаживающими ранами: лечение культивированными фибробластами, лечение эмбриональными клетками кожи и местным аппликационным применением цитокинов.

Основным патогенетическим механизмом воздействия предложенных способов лечения является активация макрофагальных клеток в области раны.

Основными классическими симптомами заболевания являлись наличие у больных раневых поверхностей, часто с гнойным отделяемым, не склонных к заживлению, боли в области раны, мацерация кожи вокруг язвы, отек конечности или наоборот наличие фибрина в ране, омозолелость краев раны и отсутствие грануляционной ткани.

У половины больных длительность существования язв составляла от 1 месяца до 3 месяцев. У 10,6% больных длительность болезни была более 1 года.

По данным бактериологических исследований раневого отделяемого чаще всего из ран высеивались Staph. аureus и Ps. aeruginosa.

При проведении исследования общего иммунного статуса были выявлены характерные изменения клеточного иммунитета 24% больных, с нарушением соотношения иммунорегуляторных клеток. Выявлено процентное содержание лимфоцитов периферической крови во всех группа на 42−62%. При лечении предложенными методами данный показатель приходил к норме на 10 сутки после лечения, в контрольной группе он оставался до 13 суток. При исследовании абсолютного количества лимфоцитов периферической крови выявили снижение лимфоцитов у больных по группам от 6% до 35%. При исследовании Т клеточных популяций выявлено повышенное содержание Т-лимфоцитов эффекторно/супрессорной популяции при нормальных показателях общего количества Т-лимфоцитов и Тлимфоцитов хелперно/индукторного типа. У обследованных больных преобладали иммунограммы с супрессивным типом, что характерно для локальных гнойных ран. При лечении предложенными новыми технологиями данные показатели приходили к норме в течение 10 суток с начала лечения. В контрольной группе больных показатели клеточного иммунитета приходили к норме на 15 сутки лечения.

Для лечения больных с ранами разного генеза нами предложены разные методы лечения с целью оценить их эффективность. Так, у больных с трофическими язвами нами использовались все три предложенные способа лечения. Для лечения больных с обширными ожогами только культивированные фибробласты на целлофановой подложке, так как этот материал можно получить за короткий период времени (три дня) и в большом количестве. Фибробласты в геле применяли на ограниченных ранах как после ожогов, вскрытия флегмон, так и на трофические язвы. Эмбриональные клетки кожи в виду исключительности материала применяли только на ранах до 100 см². Аутологичные и донорские кондиционные среды применяли также на ограниченные по размерам раны в виде аппликаций.

При трансплантации культивированных фибробластов, клеток кожи эмбриона и аппликации цитокинов происходит активация иммунокомпетентных клеток в ране и выработка биологически активных веществ — медиаторов воспаления и цитокинов которые, и стимулируют ангиогенез, миграцию эпителиоцитов от края раны. При местном применение культивированных фибробластов, клеток кожи эмбриона и цитокинов, в результате контактного воздействия с аутолимфоцитами и макрофагами проиcходит экспрессия новых рецепторов на мембранах данных клеток, что имеет значение для их активации.

В результате проведенного лечения в разных группах были обнаружены характерные различия: исчезновение перифокального отека, боли, появление грануляций, краевой и островковой эпителизации, полной эпителизации раны, нормализации количества лейкоцитов в периферической крови и т. д.

Показатели температуры у обследуемых больных, как по группам, так и в процессе лечения предложенными способами лечения значительно не изменялись. Это связано с тем, что больные предложенными методами начинали лечиться на 30,60, 90 сутки после нахождения в стационаре и имели негенерализованнные воспалительные явления. Отсутствие повышения температуры в процессе лечения доказывает отсутствие осложнений при применении предложенных способов лечения. При исследовании температуры раневой поверхности, мы не наблюдали значительных колебаний ее в процессе лечения предложенными технологиями.

Суммируя выше сказанное можно сделать вывод, что длительно незаживающая рана — хронический процесс с местной воспалительной реакцией, а местная трансплантация культивированных клеток кожи и аппликация цитокинов не вызывают осложнений со стороны организма.

При анализе динамики показателей лейкоцитов периферической крови у больных в процессе лечения, отмечено незначительное повышение данного показателя в начале предложенных способов лечения и быстрое снижение его в опытных группах. В контрольной группе данный показатель нормализовался в 2,9 раза позже. Наиболее быстрое снижение данного показателя произошло в группе, где лечение проводили цитокинами. Он нормализовался в 4 раза быстрее по сравнению с опытными группами. Это можно объяснить не только эффективностью, но и меньшей обширностью ран леченных данным способом.

При исследовании динамики изменения моноцитов периферической крови в процессе лечения, которые отражают характер воспалительной реакции, отмечено значительное повышение их у больных во второй группе, где преобладали более тяжелые больные после ожогов и обширных ран после вскрытия флегмон. В процессе лечения предложенными новыми способами данный показатель приходил к норме на 5 сутки лечения. Повышенное содержание моноцитов оставалось в контрольной группе в процессе нашего наблюдения. Не нашли мы и коррелирующего колебания моноцитов в мазках отпечатках с раневой поверхности и моноцитами периферической крови.

При исследовании белка крови, который значительно влияет на репаративные процессы в ране у наших больных, мы не выявили значительных изменений в процессе лечения данного показателя. Обосновано тем, что до нашего лечения у некоторых больных уже была проведена коррекция белка, а наше лечения не повлияло на данный показатель.

При исследования функциональной активности нейтрофилов (определение лактат катионных белков) выявлено, что у 24% больных имеется снижение функциональной активности нейтрофилов на 10%. При применении предложенных новых технологий в лечении длительно незаживающих ран данный показатель приходит к норме в третьей, четвертой группах на третьи сутки во второй на 5 сутки, в контрольной он остается сниженным в процессе всего наблюдения. Следует сделать вывод, что данный показатель является хорошим критерием определения течения раневого процесса и зная функциональную активность нейтрофилов можно корригировать дальнейшее течение воспалительного процесса применением предложенных способов лечения.

При оценке общего иммунного статуса в динамике до и после лечения, различия были выявлены лишь у больных опытных групп. Причем, положительные изменения касались только клеточного звена иммунитета и были более выражены в группе с применением культивированных фибробластов. В контрольной группе с применением традиционного метода лечения изменений иммунологических показателей отмечено не было. Следовательно, культивированные фибробласты, эмбриональные клетки кожи при местном применении, за счет продукции цитокинов вызывают иммуностимулирующее действие, направленное на клеточное звено. Местное применение цитокинов также сопровождается изменениями в общем иммунном статусе. Последние, всасываясь с раневой поверхности, обладают непосредственным иммуностимулирующим воздействием на иммунокомпетентные клетки. Закономерно не обнаруживается изменений в общем иммунном статусе и при использовании традиционного метода лечения больных с трофическими язвами.

При исследовании возбудителя в ране выявили, что наибольшей местной бактерицидной активностью обладали фибробласты, с третьих суток применения последних посевы с раны становятся стерильными. В группе с применением кондиционных сред возбудитель не определяется с пятых суток, а при применении эмбриональных клеток кожи только на седьмые сутки. В группе с применением традиционного способа лечения возбудители продолжали выделять в процессе всего наблюдения. Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод о том, что наибольшей бактерицидностью обладают фибробласты. В 1,6 раза быстрее, посевы с ран становятся стерильными по сравнению с лечением цитокинами и в 2,5 раза быстрее по сравнению с лечением эмбриональными клетками. Следует заметить, что в двух случаях у больных при применении цитокинов было отмечено обильное гнойное отделяемое, которое связываем с выраженным бактерицидным действием и стимуляцией макрофагальных клеток. На третьи сутки гнойного отделяемого не стало и появилась выраженная краевая эпителизация.

Оценивая цитологическую характеристику сравниваемых групп, можно предположить, что исходное состояние пациентов было в группах одинаковое, преобладал воспалительно — дегенеративный тип воспаления. Наилучшие результаты получены при использовании кондиционных сред и эмбриональных клеток кожи. Уже в первые сутки после лечения в грануляционной ткани появляются лимфоциты и макрофаги, с третьих суток в этих группах появляются фибробласты и эпителиальные клетки. При лечении культивированными фибробластами процесс миграции эпителиальных клеток начинается на пятые сутки. На седьмые, десятые сутки лечения во всех опытных группах начинается активная миграция эпителиальных клеток в центр раны и они определяются уже группами. Оценивая цитологические показатели мазков-отпечатков у больных опытных и контрольной групп, отмечается снижение дегенеративных форм в опытных группах в процессе лечения и они оставались на прежнем уровне в контрольной группе. В начале лечения количество нейтрофилов составляло до 95% из них дегенеративных форм в мазках отпечатках всех групп составляло до 70%. На третьи сутки после начала предложенными методами нейтрофилы составляли 75%, дегенеративные формы до 30%. На пятые сутки лечения процент дегенеративных форм сократился до 21%. В контрольной группе цитограммы оставались с дегенеративно — воспалительным типом.

При изучении гистологических срезов грануляционной ткани выявлено, что до лечения предложенными способами лечения грануляционная ткань представлена с некротическим детритом, с крупными очагами склероза, единичными очагами молодой грануляционной ткани, выраженным отеком стромы, лимфостазом и выраженной нейтрофильной инфильтрацией. В мазках определяется микрофлора как внутриклеточно, так и внеклеточно. На третьи сутки после начала лечения предложенными новыми способами нейтрофильная инфильтрация уменьшилась, появились мелкие капилляры, небольшое количество фибробластов. Микрофлора определяется единично внеклеточно.

На 10 — 12 сутки нейтрофильная инфильтрация значительно уменьшилась, микрофлора не определяется, появляются пласты эпителия. Приведенные гистологические данные полностью коррелируют с цитологическими и клиническими показателями активизации репаративной регенерации при лечении предложенными новыми способами лечения длительно незаживающих ран.

При исследовании репаративных процессов в ране изучали динамику исчезновения боли в ране и выявили, что при применении эмбриональных клеток кожи боль в ране исчезает в первые сутки и у больного улучшается сон и аппетит. При лечении больных культивированными фибробластами и цитокинами исчезновение боли наступает на третьи сутки. Исчезновение боли в ране можно связать лишь с уменьшением отека и инфильтрации мягких тканей вокруг раны, а также и непосредственного анальгезирующего действия эмбриональных клеток и самих цитокинов.

Купирование отека мягких тканей при лечении предложенными методами произошло на третьи сутки при использовании эмбриональных клеток кожи и на пятые сутки при использовании фибробластов и цитокинов. Особенно, больные отмечают положительный эффект в исчезновении боли и отека мягких тканей при применении эмбриональных клеток кожи. Видимо эмбриональные клетки кожи обладают более выраженным лимфостимулирующим действием, чем и достигается быстрое уменьшение отека мягких тканей и боли.

Время появления грануляций в опытных группах произошло при трансплантации эмбриональных клеток в первые сутки. Следует заметить, что они наиболее сильно влияют на ангиогенез, выражено стимулируя разрастание грануляционной ткани. При лечении трофических язв с применением эмбриональных клеток кожи за пять суток язва из кратерообразной превращалась в плоскую, за счет быстрого разрастания грануляционной ткани. Замечено, что при множественных трофических язвах, аппликация клеток кожи эмбриона на одну из них стимулирует репаративные процессы на соседних. Исчезает гнойное отделяемое, появляются молодые мелкие грануляции, начинается краевая эпителизация. После эпителизации раны с применением эмбриональных клеток, образуется нежный, розовый, гладкий восстановленный кожный покров. В участках, где имелись грубые гипертрофические рубцы, после применения эмбриональных клеток они исчезают, кожный покров выравнивается.

При трансплантации культивированных фибробластов и аппликации цитокинов грануляционная ткань в ране у наших больных появлялась на третьи сутки и не была такой выраженной как при трансплантации эмбриональных клеток кожи.

При исследовании появления краевой эпителизации выявлено появление ее после первых суток в виде белой полоски по краю раны при трансплантации эмбриональных клеток кожи и появление после третьих суток при применении цитокинов и фибробластов. Экспериментальные исследования гистологов доказывают, что цитокины, фибробласты и эмбриональные клетки уменьшают поверхностное клеточное натяжение в ране и усиливают миграцию краевого эпителия к центру раны. По заключению комбустиологов и нашему личному опыту рана самостоятельно может эпителизироваться только до 5 см в диаметре, свыше же 5 см в диаметре, в центре раны будет соединительнотканный рубец без эпителия. Подобную картину можно наблюдать и при небольших по размеру ранах у больных с тяжелым эндотоксикозом, когда небольшая рана закрывается соединительной тканью, но не эпителием. Применение культивированных клеток кожи и аппликации цитокинов нам позволили эпителизировать раны 10×10 и даже 12×20 см без аутодермопластики.

Интересные результаты получены при исследовании появления островковой эпителизации. Следует сразу оговориться, что все больные лечились с полным поражением кожного покрова. И никаких придатков кожи в данной ране не оставалось, потому рассчитывать на появление островковой эпителизации мы не могли. Но при применении эмбриональных клеток кожи она появилась на пятые сутки после аппликации в виде отдельных островков эпителия, до 3 — 5 мм в диаметре, при применении культивированных фибробластов островковая эпителизация появлялась на седьмые сутки после трансплантации. Островки эпителизации могли находиться как в одном сантиметре от края раны, так и в трех сантиметрах от края раны. Следует отметить, что некоторые из них в последующем могли лизироваться. Что позволяет заключить, что островковая эпителизация могла появиться как за счет клеток краевого эпителия, так и живой эпителиальной клетки эмбриона. Есть экспериментальные доказательства, что, если трансплантировать фибробласты дермы, то они могут давать полноценную репаративную регенерацию кожи, вплоть до восстановления волос. При аппликационном лечении ран цитокинами островковой эпителизации не наблюдали. В контрольной группе вышеописанных изменений в ране в процессе лечения не наблюдали. Сравнивать время появления краевой, островковой эпителизации трудно, ее не было месяцами, годами и вдруг рана эпителизируеся за 12 — 25 суток.

Время полной эпителизации ран при применении культивированных фибробластов наступило в среднем на 15 сутки после начала лечения. При применении клеток кожи эмбриона и аппликациионого применения цитокинов в среднем на 12 сутки после начала лечения. При трофических язвах средние сроки эпителизации одно и двух годичных язв произошло на 21 — 25 сутки. Самое скромное сравнение методов лечения всех четырех групп, позволяет заключить, что репаративные процессы в кожной ране при применении предложенных новых технологий происходят в 2 — 3 раз быстрее.

Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о том, что местное применение культивированных фибробластов, клеток кожи эмбрионов и цитокинов является патогенетически обоснованным и эффективным методом лечения длительно незаживающих ран и трофических язв нижних конечностей. Обладая иммуномодулирующей активностью культивированные клетки, клетки кожи эмбриона и цитокины снижают активность воспаления в ране и окружающих тканях, что сопровождается уменьшением отека и инфильтрации ткани, повышением миграции краевого эпителия к центру раны. Внедрение предложенных способов лечения этой сложной патологии в клиническую практику позволит оптимизировать результаты лечения больных. Дальнейшее изучение методов культивирования клеток кожи и их применения в медицине позволят наладить производство аутои алло кожи в лабораторных условиях пригодной для закрытия обширных раневых поверхностей.