Методы изучения цитокинов

В комплексный анализ системы цитокинов входит следующее.

I. Оценка клеток-продуцентов.

• 1. Определение экспрессии:
  • · рецепторов, распознающих патоген или антиген TКР, TLR) на уровне генов и молекулы белка (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии);
  • · адаптерных молекул, проводящих сигнал, запускающий транскрипцию цитокиновых генов (ПЦР и др.);
  • · генов цитокинов (ПЦР); белковых молекул цитокинов (оценка цитокинсинтезирующей функции мононуклеарных клеток человека).
• 2. Количественное определение субпопуляций клеток, содержащих те или иные цитокины: Th1, Th2 Th17 (метод внутриклеточного окрашивания цитокинов); определение количества клеток, секретирующих определенные цитокины (метод ELISPOT).

II. Оценка цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма.

• 1. Tестирование биологической активности цитокинов.
• 2. Количественное определение цитокинов с помощью ИФА.
• 3. Иммуногистохимическое окрашивание цитокинов в тканях.
• 4. Определение соотношения оппозитных цитокинов (прои противовоспалительных), цитокинов и антагонистов рецепторов цитокинов.

III. Оценка клеток-мишеней.

• 1. Определение экспрессии рецепторов цитокинов на уровне генов и белковой молекулы (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии).
• 2. Определение сигнальных молекул во внутриклеточном содержимом.
• 3. Определение функциональной активности клеток-мишеней.

В настоящее время разработаны многочисленные методы оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию. Среди них различают:

• 1) молекулярно-биологические методы;
• 2) методы количественного определения цитокинов с помощью иммуноанализа;
• 3) тестирование биологической активности цитокинов;
• 4) внутриклеточное окрашивание цитокинов;
• 5) метод ELISPOT, позволяющий выявить цитокины вокруг единичной цитокинпродуцирующей клетки;
• 6) иммунофлюоресценцию.

Краткая характеристика этих методов:

С помощью молекулярно-биологических методов можно исследовать экспрессию генов цитокинов, их рецепторов, сигнальных молекул, изучать полиморфизм указанных генов. В последние годы выполнено большое число работ, выявивших ассоциации между вариантами аллелей генов молекул системы цитокинов и предрасположенностью к ряду заболеваний. Изучение аллельных вариантов генов цитокинов может дать информацию о генетически запрограммированной продукции того или иного цитокина. Наиболее чувствительной считается полимеразная цепная реакция в реальном времени — ПЦР-РВ. Метод гибридизации in situ позволяет уточнить тканевую и клеточную локализацию экспрессиии цитокиновых генов.

Количественное определение цитокинов в биологических жидкостях и в культурах мононуклеарных клеток периферической крови методом ИФА можно охарактеризовать следующим образом. Поскольку цитокины являются локальными медиаторами, более целесообразно измерять их уровни в соответствующих тканях после экстракции тканевых протеинов или в естественных жидкостях, например, в слезе, смывах из полостей, моче, амниотической жидкости, спинномозговой жидкости и т. д. Уровни цитокинов в сыворотке или других биологических жидкостях отражают текущее состояние иммунной системы, т. е. синтез цитокинов клетками организма in vivo.

Определение уровней продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови (МНК) показывает функциональное состояние клеток. Спонтанная продукция цитокинов МНК в культуре свидетельствует, что клетки уже активированы in vivo. Индуцированный (различными стимуляторами, митогенами) синтез цитокинов отражает потенциальную, резервную способность клеток отвечать на антигенный стимул (в частности, на действие лекарственных препаратов). Сниженная индуцированная продукция цитокинов может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Цитокины не специфичны в отношении конкретного антигена. Поэтому специфическая диагностика инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний с помощью определения уровня тех или иных цитокинов невозможна. В то же время оценка уровней цитокинов позволяет получить данные о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и прогнозе, функциональной активности клеток иммунной системы, о соотношении Th1- и Th2-клеток, что очень важно при дифференциальной диагностике ряда инфекционных и иммунопатологических процессов.

В биологических средах можно определить цитокины количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа, используя поликлональные и моноклональные антитела. ИФА позволяет узнать, каковы точные концентрации цитокинов в биологических жидкостях организма. Иммуноферментное выявление цитокинов имеет ряд преимуществ перед другими методами (высокая чувствительность, специфичность, независимость от присутствия антагонистов, возможность точного автоматизированного учета, стандартизации учета). Однако и этот метод имеет свои ограничения: ИФА не характеризует биологическую активность цитокинов, может давать ложные результаты за счет перекрестно-реагирующих эпитопов.

Биологическое тестирование проводят на основе знания основных свойств цитокинов, их действия на клетки-мишени. Изучение биологических эффектов цитокинов позволило разработать четыре разновидности тестирования цитокинов:

• 1) по индукции пролиферации клеток-мишеней;
• 2) по цитотоксическому эффекту;
• 3) по индукции дифференцировки костномозговых предшественников;
• 4) по противовирусному действию.

ИЛ-1 определяют по стимулирующему действию на пролиферацию мышиных тимоцитов, активированных митогеном in vitro; ИЛ-2 — по способности стимулировать пролиферативную активность лимфобластов; по цитотоксическому действию на мышиные фибробласты (L929) тестируют ФНОа и лимфотоксины. Колониестимулирующие факторы оценивают по их способности поддерживать рост костномозговых предшественников в виде колоний в агаре. Противовирусную активность ИФН выявляют по угнетению цитопатического действия вирусов в культуре диплоидных фибробластов человека и опухолевой линии фибробластов мышей L-929.

Созданы клеточные линии, рост которых зависит от присутствия определенных цитокинов. В таблице представлен список клеточных линий, используемых для тестирования цитокинов.

Таблица — Клеточные линии, используемые для тестирования биологической активности цитокинов.

По способности индуцировать пролиферацию чувствительных клеток-мишеней проводят биотестирование ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-15 и др. Однако эти методы тестирования отличаются недостаточной чувствительностью и информативностью. Молекулы ингибиторов и антагонистов могут маскировать биологическую активность цитокинов. Некоторые цитокины проявляют общую биологическую активность. Тем не менее эти методы идеальны для тестирования специфической активности рекомбинантных цитокинов.

Определение биологической активности ИЛ-1 по комитогенному действию на пролиферацию тимоцитов мышей В основе метода биологического тестирования ИЛ-1 лежит способность цитокина стимулировать пролиферацию мышиных тимоцитов.

ИЛ-1 может быть определен в культуре моноцитов, стимулированных ЛПС, а также в любой биологической жидкости организма. Необходимо обратить внимание на ряд деталей.

• 1. Для тестирования применяют тимоциты мышей линии С3Н/ HeJ, стимулированные к пролиферации митогенами (конканавалин, А — КонА и фитогемагглютинин — ФГА). Тимоциты С3Н/HeJ выбраны не случайно: мыши этой инбредной линии не отвечают на ЛПС, который может находиться в составе тестируемого материала и вызывать продукцию ИЛ-1.
• 2. Тимоциты отвечают на ИЛ-2 и митогены, поэтому в препаратах, тестируемых на ИЛ-1, следует определять также присутствие ИЛ-2 и митогенов.