Методы определения. 
Полисахариды растений как перспективный источник получения лекарственных средств. 
Структура, физико-химические свойства, методы анализа

В настоящее время для этих целей используют классические методы химии углеводов, комбинирование методов структурной химии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (спектроскопии ЯМР), методы химической и ферментативной модификации, хроматографические методы (газо-жидкостная хроматография (ГЖХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), гельпроникающая хроматография), а также методы световой микроскопии и электрофорез[36]. В последние годы для установления тонкой структуры полисахаридов стали использовать различные виды масс-спектрометрии[37].

ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием В 1950;х годах инфракрасные спектры (ИК-спектры) большинства углеводов были описаны при попытке соотнести различия в структуре моно-, олигои полисахаридов. Обнаружено, что аномерные формы гликозидов легко различимы в ИК-спектрах, а частоты от 1240 до 820 см-1 указывают на распределение сульфатных групп, присутствующих в гиалуроновой кислоте и 30 мукополисахаридах. Позже, данный метод стали применять для анализа сульфатированных полисахаридов красных водорослей.

Открытие в 1965 г. Метода быстрого Фурье преобразования позволило разработать новое поколение ИК-спектрометров с Фурье-преобразованием, оснащенных программным обеспечением, способным выполнять обработку спектральных данных. Этот метод является быстрым, не требует больших количеств веществ и в результате анализа вещество не разрушается, что, несомненно, является преимуществом метода.

В ИК-спектрах углеводов можно выделить пять областей. Область 3600−2800 см-1 соответствует валентным колебаниям O-H и C-H, тогда как область 1500−1200 см-1 относится к области локальной симметрии. Полосы поглощения при 1200−950 см-1 отражают C-O валентные колебания, область 950−700 см-1 называют областью «отпечатков пальцев» или аномерной, область ниже 700 см-1 — скелетная область[38].

Cпектроскопия 13С ЯМР Спектры 1 Н и 13С ЯМР дают более полную информацию о составе и строении полисахаридов, чем ИК-спектры. Использование 13С ЯМР спектроскопии для установления первичной структуры галактанов было предложено в 1978 г. Спектры 13С ЯМР характеризуются довольно большим диапазоном химических сдвигов атомов углерода, и даже небольшие изменения в окружении атомов углерода вызывают ощутимое изменение значений химических сдвигов. В связи с этим, спектроскопия 13С ЯМР, по сравнению со спектроскопией 1 Н ЯМР, явлется наиболее информативным методом при установлении структуры гибридных полисахаридов. Так, например, замещение атома кислорода МС остатка (гликозилирование, метилирование или сульфатирование) приводит к сдвигу сигнала на 6−11 м.д. в область слабого поля для атома углерода, несущего заместитель (б-эффект замещения), и на 2−4 м.д. в область сильного поля для двух соседних атомов (в-эффект). Образование 3,6 — ангидрокольца, которое можно рассматривать как продукт внутримолекулярного замещения одновременно при О-3 и О-6 остатка галактозы, вызывает конформационную инверсию пиранозного кольца и значительное изменение в химических сдвигах всех атомов углерода по сравнению с исходным галактопиранозным остатком. Таким образом, спектры 13С ЯМР регулярных полисахаридов соответствуют спектрам дисахаридов и представляют собой 12 хорошо разрешенных сигналов.

Для получения хорошо разрешенного спектра ЯМР образец полисахарида обрабатывают ультразвуком и снимают спектр при повышенной температуре с целью уменьшения вязкости раствора полимера[38].

Значения химических сдвигов рассчитывают относительно таких внутренних стандартов, как диметилсульфоксид (ДМСО), тетраметилсилан (ТМС) и метанол. Недостатком ТМС, затрудняющим его широкое использование, является плохая растворимость в полярных растворителях, даже таких, как вода. В связи с этим, комиссия ИЮПАК предложила использовать 2,2 — диметил-2-силапентан — 3,3,4,4,5,5 — d6−5-сульфонат натрия (ДСС) в качестве единого эталона для спектроскопии 1 Н и 13С ЯМР в сильнополярных растворителях. Следует отметить, что химические сдвиги спектров 13С ЯМР для галактанов относительно ДСС оказываются в среднем на 2,1 м.д. больше, чем сдвиги относительно ТМС, в 34 то время как в спектрах 1 Н ЯМР химические сдвиги незначительно отличаются от тех, что были получены ранее.

Спектроскопия 13С ЯМР имеет невысокую чувствительность, поэтому информация о минорных компонентах полисахаридов может быть недоступна. Тем не менее, остатки пировиноградной кислоты, входящие в состав сложных полисахаридов, можно определить по характерным сигналам их атомов углерода вместе с 1,3 — связанной D-галактозой.

Достоинством спетроскопии 13С ЯМР является его высокая информативность. Количественное определение состава смеси сульфатированных полисахаридов основано на интенсивности резонансов аномерных атомов углерода обоих колец дисахаридного звена.

Может проводится дополнительная химическая модификация. Так для структурного анализа сложных галактанов, в молекуле которых встречается несколько различных повторяющихся звеньев, предложен новый подход, заключающийся в сопоставлении спектров 13С ЯМР нативного полисахарида, продукта его метилирования и продуктов десульфатирования этих двух полимеров[38].

Спектроскопия 1 Н ЯМР Преимущество спектроскопии 1 Н ЯМР перед 13С ЯМР заключается в высокой чувствительности метода, что позволяет анализировать меньшее количество вещества с меньшими затратами времени.

В последнее время для анализа сложных полисахаридов используются различные виды двумерной спектроскопии: 1 Н- 1 Н COSY (корреляционная 36 спектроскопия), 1 Н- 1 Н ROESY (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат), 1 H — 13C HSQC (гетероядерная одноквантовая корреляция), которые позволяют провести отнесение сигналов протонов МС остатков и осуществить углерод-протонную корреляцию. Данные, полученные при анализе таких двумерных спектров, позволяют определить положение заместителей. Двумерная спектроскопия является важнейшим инструментом при установлении новых структур полисахаридов, не требующим проведения дополнительных химических модификаций[38].

Ферментативные методы:

Сейчас при анализе гибридных структур галактанов часто используют специфические ферменты — агаразы и каррагиназы.

Ферментативный анализ является чувствительным методом, с помощью которого можно установить тонкие детали структуры, не идентифицируемые методами спектроскопии и химическими методами. Данный метод позволяет получить фрагменты полимера, состоящие из повторяющихся единиц, которые могут быть структурно целыми, и изучить их распределение вдоль полимерной цепи. Основными продуктами ферментативного гидролиза сульфатированных полисахаридов являются олигосахариды с определенной длиной цепи, для разделения которых используют высокоразрешенную хроматографию[38].

Агаразы — ферменты, катализирующие гидролиз агара. Источниками этих ферментов являются морские грамотрицательные бактерии.

Следует отметить, что активность ферментов чувствительна к таким параметрам, как Рн и температура среды. Так, например, температура гелеобразования агара около 38 °C, поэтому большинство агараз проявляют активность при температуре 30 °C, за исключением бактерий Vibrio sp. JT0107 и Alteromonas sp. C-1. Большинство ферментов нестабильны при высоких температурах. Кроме того, большинство агараз проявляют оптимальную активность при нейтральном и слабощелочном Рн[38].