Введение. 
Использование полиморфизма генов репарационных систем в качестве маркера предрасположенности к мультифакторным заболеваниям

В последнее время все чаще можно услышать о митохондриальных болезнях. Что же представляют собой эти тяжелые наследственные заболевания? Как следует из названия, это болезни, вызванные дефектами митохондрий — органелл, находящихся в цитоплазме клеток. В одной клетке у человека может присутствовать до 1000 этих внутриклеточных структур. Основная функция митохондрий — выработка и запасание энергии. На наших внутриклеточных «энергетических станциях» работают более 80 ферментов, которые перерабатывают поступающее из цитоплазмы «сырье» — продукты клеточного обмена веществ, а выделяющуюся при этом энергию запасают в форме молекул АТФ. В дальнейшем запасённая таким образом энергия преобразуется: в мышечных клетках — в механическую энергию, в нервных — в биоэлектрическую, в клетках канальцевого эпителия почек — в энергию активного транспорта и т. д.

Дефект любого из ферментов митохондрий нарушает слаженную работу всей «энергетической станции». При этом в первую очередь страдают наиболее энергозависимые ткани и органы — центральная нервная система, скелетные и сердечная мышцы, почки, печень, эндокринные железы. На фоне хронического дефицита энергии в них рано или поздно возникают патологические изменения и развиваются заболевания, которые получили название митохондриальных. Современной медицине известно около 50 таких болезней. В их клинике встречается самая различная патология, но доминируют поражения центральной нервной системы и мышечной ткани. Симптомами, типичными для митохондриальных заболеваний, являются мышечные боли, слабость и атрофия мускулатуры, непереносимость физических нагрузок, птоз, полинейропатия, судороги, отсутствие рефлексов, атрофия зрительного нерва, нейросенсорная тугоухость, мигрени, летаргические состояния, изменения психомоторного развития, олигофрения и деменция.

Характерные особенности проявления и наследования митохондриальных заболеваний во многом обусловлены уникальностью митохондрий как клеточных структур. Митохондрии внутри клеток ведут себя полуавтономно — они имеют собственную ДНК, делятся, синтезируют собственные белки. Существует точка зрения, что митохондрии — это древние внутриклеточные симбионты. Эти органеллы не всегда присутствовали в клетках. Когда-то, еще на заре эволюции, их предшественники — бактерии с эффективным способом кислородного дыхания — были поглощены более крупными клетками, но не переварены ими, а каким-то образом вовлечены в процесс добывания энергии. Свои услуги они предоставляли не бескорыстно, а в обмен на защиту и пропитание. За несколько миллиардов лет эволюции сформировался прочный союз, и сейчас бывшие бактерии — митохондрии — являются неотъемлемой частью эукариотической клетки. Их обмен веществ так тесно переплетен, что ни митохондрии, ни клетки не могут существовать отдельно друг от друга. Все, что осталось от былой независимости митохондрий — это собственный геном со своим генетическим кодом, не таким, как в ядре, а похожим на код бактерий.

Объём митохондриального генома невелик, у человека он содержит от 1 до 8 копий небольшой кольцевой молекулы ДНК. Каждая из этих митохондриальных хромосом кодирует 13 белков — ферментов, ответственных за синтез АТФ, а также рибосомальные и транспортные РНК, участвующие в митохондриальном синтезе белка. Большая часть белков митохондрий (около 70) кодируется генами ядерной ДНК, которая таким образом контролирует работу этих «независимых» органелл, осуществляя централизованную регуляцию их функций в соответствии с энергетическими потребностями всей клетки.

Мутации, нарушающие функции митохондрий, могут происходить как в митохондриальном, так и в ядерном геномах, но большинство дефектов, приводящих к развитию митохондриальной патологии, возникает в генах самих митохондрий. Эти органеллы являются своеобразной зоной повышенного мутационного риска: интенсивно протекающие в них окислительно-восстановительные процессы с избытком поставляют свободные радикалы, повреждающие ДНК. Митохондриальная ДНК, в отличие от ядерной, не защищена белками-гистонами, а древние, доставшиеся от бактериеподобных предков, механизмы репарации её повреждений несовершенны. Поэтому в митохондриальной ДНК мутации накапливаются в 10−20 раз быстрее, чем в ядерной ДНК.

Мутации, возникшие в митохондриальных генах, передаются в новые митохондрии при делении этих органелл. Получается, что даже в пределах одной клетки присутствуют митохондрии с разными вариантами геномов. Это явление называется гетероплазмией. Человек с мутацией в митохондриальном гене несет смесь нормальной и мутантной ДНК, причем соотношение митохондрий с мутантными и нормальными геномами может быть каким угодно, поэтому выраженность митохондриальных заболеваний у разных больных неодинаковая. В подобных случаях мутации поначалу могут вообще не иметь внешних проявлений. Нормальные митохондрии до поры до времени обеспечивают клетки энергией, компенсируя недостаточность функции митохондрий с дефектами. На практике это проявляется более или менее длительным бессимптомным периодом при многих митохондриальных заболеваниях. Однако рано или поздно наступает момент, когда дефектные формы накапливаются в количестве, достаточном для проявления патологических признаков. Возраст манифестации заболевания варьирует у разных больных. Раннее начало заболевания приводит к более тяжелому течению и неутешительному прогнозу.

Наследование мутаций в митохондриальном геноме носит особый характер. Если гены, заключенные в ядерной ДНК, дети получают поровну от обоих родителей, то митохондриальные гены передаются потомкам только от матери. Это связано с тем, что всю цитоплазму с содержащимися в ней митохондриями потомки получают вместе с яйцеклеткой, в то время как в сперматозоидах цитоплазма практически отсутствует. По этой причине женщина с митохондриальным заболеванием передаёт его всем своим детям, а больной мужчина — нет.

Диагностика митохондриальных болезней осуществляется на основании комплекса биохимических и цитологических показателей. Ключевую роль играет ДНК-диагностика. Следует заметить, что для митохондриальных патологий характерна высокая изменчивость клинических форм, что затрудняет их идентификацию; в большинстве случаев диагноз ставится уже на финальных стадиях развития болезни.

Лечение митохондриальных болезней проводится обычно по двум основным направлениям. Первое — повышение эффективности энергетического обмена в тканях. Для этого дополнительно вводятся препараты, компоненты которых обеспечивают тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование (тиамин, рибофлавин, никотинамид, коэнзим Q10, витамин С, цитохром С и др.). Второе направление терапии — предупреждение повреждения митохондриальных мембран свободными радикалами с помощью антиоксидантов (витамин Е и др.) и мембранопротекторов.

Недавно учёными из Университета Ньюкасла (Великобритания) был предложен оригинальный способ предотвращения митохондриальных заболеваний. Идея состоит в том, чтобы получать эмбрион от трёх родителей! Ядро оплодотворенной яйцеклетки от матери с генетическими отклонениями имплантируется в донорскую яйцеклетку с удалённым ядром. При этом ядерная ДНК, как и положено, передаётся ребёнку поровну от отца и матери, а цитоплазма — от третьего лица, женщины с нормальными митохондриями. полиморфизм ген митохондриальный И последнее, что хочется сказать о митохондриях. Накопление мутаций в митохондриальной ДНК рассматривается учёными как один из основных факторов нейродегенеративных заболеваний и старения. Считается, что, предотвращая эти мутации, можно будет увеличить продолжительность жизни. Возможно, изучая митохондрии, современная наука вплотную приблизилась к пониманию механизмов старения и решению проблемы долголетия.

Развитие атомной промышленности, а также методов радиационной медицины приводит к расширению сферы контактов человека с источниками радиации. Реакция тканей и организма в целом на радиационное воздействие обусловлена взаимодействием целого ряда клеточных и молекулярных факторов. При хроническом радиационном воздействии невысокой мощности реакция тканей на одинаковые дозы радиации, а также тяжесть негативных последствий облучения варьируются на индивидуальном уровне. В связи с этим, востребована разработка новых технологий реабилитации хронически облучённых людей с использованием индивидуальных подходов к диагностике, оценке радиационных рисков и коррекции выявляемых нарушений.

Актуальность проблемы обусловлена, в частности, последствиями глобальных техногенных катастроф на атомных электростанциях в Чернобыле (Украина) ипрефектуре Фукусима (Япония), приведших к многочисленным жертвам среди населения и лиц, задействованных в ликвидации аварий.

Установлено, что ионизирующее излучение повышает риск развития злокачественных новообразований (ЗНО) [2, 3]. Риск развития онкологических заболеваний определяется действием многих факторов, как внешних, так и внутренних, обусловленных особенностями метаболизма и наследуемой (генетической) предрасположенностью к заболеванию.

Генетическая составляющая играет важную роль в развитии всех мультифакториальных заболеваний. Так, например, возникновение ЗНО, в среднем, на 30% обусловлено влиянием полиморфизма генов [4], а в случае с аутоиммунными нарушениями этот показатель достигает 50−60% [5]. Это позволяет предположить влияние генотипа на риск возникновения отдалённых эффектов облучения, прежде всего, онкопатологии.

В ходе изучения динамики апоптоза облученных культур CD8+ лимфоцитов, а также по результатам исследований экспрессии генов в группах пациентов с выраженной реакцией на радиационное воздействие было установлено, что основные гены, определяющие радиочувствительность, относятся к системам репарации ДНК, апоптоза и окислительного стресса [6,7].

Полиморфизм этих генов может быть причиной структурно-функциональных изменений белков, а это, в свою очередь, может приводить к отличиям в реакции тканей на облучение.

Исходя из этого, нами были разработаны тест-системы для определения кандидатных генетических маркеров, ассоциированных с риском развития отдалённых последствий облучения. На сегодняшний день наиболее удобным маркером с точки зрения технологии и стоимости анализа являются однонуклеотидные полиморфизмы или SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Часто SNP не связаны с признаком напрямую, однако плотность их распределения в геноме (примерно 1 на 300 п.н.) позволяет отобрать те из них, которые расположены вблизи от генетической вариации, непосредственно влияющей на свойства продукта гена, и наследуются вместе с ней в составе единого локуса.

Кроме того, SNP эволюционно стабильны, широко распространены и почти всегда биаллельны, что позволяет легко адаптировать технологию генотипирования к использованию в лечебных учреждениях и диагностических центрах.

В панель кандидатных маркеров вошли пять SNP, расположенных в генах ATM, TGFB1, XRCC1, OGG1, а также четыре маркера, расположенных в интроне 8q24 на 8 хромосоме.

Выбор кандидатных генов и SNP в них основан на полученных ранее результатах, демонстрирующих достоверную ассоциацию маркеров, расположенных в этих генах с различными клиническими симптомами, обусловленными облучением и, в частности, с повышенным риском развития онкологических заболеваний [8, 9].

Целью исследования стала оценка ассоциации кандидатных SNP-маркеров с формированием фенотипа, характеризующегося повышенной устойчивостью тканей к хроническому облучению. С помощью разработанных тест-систем были определены частоты встречаемости кандидатных SNP-маркеров в группе устойчивых к радиационному воздействию пациентов относительно популяционного контроля.