Вестерн блоттинг. 
Экспрессия белка ТБГ3 Х-вируса шалота

После выделения пламидной ДНК из E. сoli была проведена трансормация клеток Agrobacterium tumefaciens, а затем агроинфильтрация по стандартным методикам. Культурами агробактерий, несущими рекомбинантные плазмиды, были инфильтрированы листья растений Nicotiana benthamiana. Отбор проб проводился на третий день после инфильтрации. Вестерн-блоттинг делался с мышиными антителами к 3HA.

Полуколичественный ПЦР

Выделение РНК из препаратов листа проводился с помощью горячего фенола.

Полуколичественный ПЦР делался.

• А) С праймерами к ТБГ3 для определения количества мРНК, кодирующей ТБГ2/ТБГ3 последовательность
• Б) С праймерами к eEF1 для определения среднего количества тотальной РНК.

Результаты

Чтобы определить характеристические особенности потенциально транслирующегося ТБГ3 белка алексивирусов, было построено множественное выравнивание, содержащее всех представителей алексивирусов, чей геном уже секвенирован. Гомологи ТБГ3 алексивирусов показали довольно высокую степень родства друг с другом, когда расстояния и отдаленное родство с представителями других родов (рис. 5). В частности, в потенциально транслируемом белке была найдена консервативный мотив (CX₅GX₅C), характерный для ТБГ3 белков потексвирусов, и один гидрофобный трансмембранный участок перед ним (TMD), что также характерно для потексвирусов. Консервативность ТБГ3-кодирующей последовательности во всех алексивирусах говорит о возможности экспрессии белка ТБГ3. Было предложено, что эта экспрессия начинается с неканонического стартового кодона.

Рис. 5. Множественное выравнивание ТБГ3 аминокислотных последовательностей

Плюсами обозначены участки консервативных остатков, характерных для потексвирусов. TMD — трансмембранный домен, звездочкой обозначен инвариантный консервативный лейцин.

Если трансляция начинается с неканонического стартового кодона, логично предположить, что этот кодон будет консервативен у всех алексивирусов, включая его позицию и окружение. Действительно, более детальное изучение выровненных последователньостей выявило присутствие инвариантного Leu остатка, закодированного во всех случаях кодоном CUG, который, как известно (см. выше), является самым эффективным из возможных неканонических инициаторных кодонов. Интересно, что у всех алексивирусов этот CUG был найден в оптимальном окружении для инициации трансляции (AXXCUGG), в то время как AUG кодон ТБГ2 нахоится в слабом окружении (C/UXXAUGA) (рис. 6).

Рис. 6. Окружение инициаторных кодонов

Наконец, не было найдено ни одного AUG кодона между инициатором ТБГ2 и предположительным стартовым CUG-кодоном ТБГ3. Эти данные поддерживают гипотезу об инициации экспрессии ТБГ3 с CUG кодона с помощью механизма LRS.

Для экспериментальной проверки этого предположения были сконструированы две конструкции, включающие участок генома ShVX, несущий последовательности ТБГ2 и ТБГ3 под контролем сильного растительного 35S-промотора. Эти конструкции были клонированы в составе бинарного вектора pLH. В обоих вариантах предположительный ген ТБГ3 был слит в одной рамке трансляции с эпитопом вируса гриппа (triple hemagglutinine tag, 3HA). Первая конструкция содержит нативную ТБГ2/ТБГ3 последовательность, а вторая несет точечную мутацию предположительного инициаторного кодона CUG в CAG. Вестерн блоттинг показал, что экспрессия белка ТБГ3 происходит только в случае нативной последователньости ТБГ2/ТБГ3. Мутация же CUG кодона приводит к полному блокированию синтеза ТБГ3. В то же время полуколичественный ПЦР выявил сходный уровень мРНК, служащих матрицей для трансляции ТБГ2 и ТБГ3. Это говорит о том, что мутация CUG кодона влияет на инициацию трансляции ТБГ3, но не на стабильность мРНК (рис. 7).