Молекулярно-генетический метод. 
Использование в судебной медицине методов изучения наследственности человека

Генотипоскопический метод идентификации

Установление или исключение происхождения крови от конкретного лица один из важнейших моментов процесса раскрытия и расследования преступления, особенно если это кровь жертвы на человеке, подозреваемом в совершении преступления, или наоборот, кровь подозреваемого на жертве или месте преступления.

Для решения этой задачи в настоящее время в большинстве случаев судебные медики проводят определение групповой принадлежности крови по различным ее системам.

В последнее время биологической наукой разработан и успешно внедряется в повседневную практику метод генотипоскопической идентификации человека, в основе которого лежит методика анализа дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), находящейся в ядрах любых клеток организма человека. Первым объектом судебно-медицинской экспертизы, для которого эта методика была детально разработана, была кровь. Этим методом может быть исследована как жидкая, так и сухая кровь.

Достижения генетиков в определении специфичности ДНК индивидуума привлекли внимание судебных медиков. Была разработана совместная программа внедрения молекулярно-генетических методов при исследовании следов биологического происхождения, в том числе и при исследовании вещественных доказательств.

Возможность такого исследования основывается на индивидуальности строения некоторых участков молекулы ДНК, их назвали гипервариабильными (ГВ) участками. Строение этих отрезков молекул не только индивидуально у каждого человека, но и строго повторяется во всех органах и тканях тела одного человека, (рис. 4).

Теоретически метод генотипоскопической идентификации является самым универсальным, так как с его помощью, в принципе, можно идентифицировать самые различные объекты биологического происхождения, если только в них сохранилось небольшое количество молекул ДНК или их частей.

Используя высокоэффективные технические средства, можно получать результат с вероятностью ошибки меньшей чем один раз на несколько миллиардов случаев. То есть выделять одного-единственного человека из всего множества живущих на земле.

Универсальность и высокая индивидуальность результатов делают этот метод наиболее перспективным среди всех остальных методов идентификации человека в случаях непосредственного исследования объектов биологического происхождения.

Существует несколько вариантов технологии проведения исследований молекулы ДНК в целях идентификации человека. Один из вариантов основан на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (фрагментов, получаемых путем рассечения молекулы). Сокращенно его называют ПДРФ анализ (используют для исследования жидкой крови).

Технология такого исследования в общих чертах состоит из следующих этапов:

• 1. Выделение молекул ДНК из исследуемого материала. (Молекулы ДНК находятся в ядрах клеток в структуре ДНК.)
• 2. Фрагментирование (разделение на фрагменты) молекул ДНК с помощью ферментов — рестриктаз (эндонуклеаз). Существует множество видов рестриктаз, которые разрезают молекулу ДНК в местах, присущих только им, т. е. каждый вид рестриктазы только в том месте, в котором ему положено его химической природой.

После такого воздействия на молекулу ДНК образуется множество фрагментов, которые отличаются друг от друга составом, длиной и, соответственно, молекулярным весом.

• 3. Смесь фрагментов ДНК разделяют методом электрофореза в геле. Метод основывается на том, что под воздействием электрического тока фрагменты ДНК передвигаются в специальной среде — геле. Чем они легче и мельче, тем дальше они уходят от стартовой позиции.
• 4. Из всего набора фрагментов, расположенных на разных участках электрофоретической пластинки, с помощью специальных зондов выявляют полиморфные фрагменты. Зонды при этом обычно маркируют радиоактивными изотопами или нерадиоактивными метками. Что позволяет получить на специальной мембране видимый набор линий разной ширины, соответствующих числу и виду гипервариабельных (ГВ) фрагментов. Расположение отдельных линий варьирует у разных людей, а их совокупность индивидуальна, (рис. 5)

Целесообразно производить параллельное исследование известного по происхождению объекта (от А) и неизвестного (от X). Полученные «картинки» распределения ГВ фрагментов сравнивают между собой с использованием методов математического анализа. Рассчитывают возможность случайного совпадения изображений. При очень маленькой вероятности случайного совпадения ею пренебрегают и считают, что сравниваемые объекты идентичны, а, следовательно, установлена личность человека от которого произошел ранее неизвестный объект X.

Метод позволяет сравнивать между собой результаты исследования неизменных молекул ДНК из ядер клеток крови, спермы и любых других тканей тела человека. «Картинка» расположения ГВ-фрагментов не изменяется на протяжении всей жизни человека, она индивидуальна. Полное сходство «ДНК-узоров» наблюдается только у однояйцовых близнецов. У родственников выявляется сходство генотипических узоров, что позволяет устанавливать родство.

В последнее время разработан и активно внедряется в экспертную практику метод, позволяющий проводить исследование очень малых количеств разрушенных молекул ДНК. Метод основан на том, что перед исследованием ГВ-участков имеющиеся фрагменты ДНК многократно копируются, тем самым наращивается, до необходимого, объем материала, подлежащего исследованию. Этот метод получил название — метод амплификации (реакции цепной полимеризации). В ноябре 1992 года было проведено первое определение спорного отцовства при помощи ПЦР-анализа. Научно обоснованное применение этого метода в экспертизах спорного отцовства стало возможным только благодаря проведенному анализу частоты встречаемости аллелей гипервариабельных участков ДНК в популяции, проживающей в Одесской области /Г.Ф.Кривда, Ю. М. Сиволап, Н.Э.Кожухова/. В результате, 2 января 1995 г. в г. Одессе проведена первая экспертиза биологических следов.

Проблема выделения и очистки ДНК из этих следов не вызвала особых проблем у генетиков, учитывая, что ДНК есть ДНК, и методы ее исследования практически одинаковы для всех живых организмов, а растительная клетка, являющаяся для специалистов уже изведомой, многофункциональна и представляет один из самых трудных объектов для выделения ДНК.

Вместе с тем, специалистам удается выделять ДНК из неординарных объектов: в Одесское облбюро судмедэкспертизы был доставлен хрящ умершего ребенка с полугодичным сроком захоронения. Поставлена задача — установить действительно ли захоронен ребенок родителей, обратившихся на генетическое исследование. Научному сотруднику СГИ удалось выделить из эксгумированного хряща ДНК и установить, что родители имели веские основания сомневаться.

Разрешающая способность геномной дактилоскопии увеличилась в значительной мере с введением анализа микросателитов — небольших вариабельных, а значит, специфических участков ДНК. Со временем ДНК на биологических объектах — следах подвергаются разрушению. Огромная молекула превращается в комок фрагментов. Именно с помощью микросателитов типируются и такие небольшие участки деградированной ДНК. Если биологический объект пролежал несколько месяцев /лет/ в сухих условиях и там сохранились хотя бы фрагменты ДНК, то возможно при помощи микросателитов опознать хозяина следа. С внедрением в практику этой модификации генотипоскопии было устранено одно из наиболее существенных препятствий на пути практического судебно-медицинского и криминалистического использования метода, заключающееся в ограничениях материала, необходимого для проведения результативного исследования, по объему и качеству.

С 1999 года 20 микросателитных локусов /точек на хромосоме/ на службе Одесской судмедэкспертизы. В отделе молекулярной генетики СГИ имеется уникальный прибор-синтезатор ДНК, на котором синтезируются микросателиты.

По ряду вопросов методического характера Одесские молекулярные генетики получают консультации по электронной почте у известного специалиста по использованию ДНК-типирования в судебной медицине Марка Беннека из Кельнского университета.

Именно благодаря тому, что ученые генетики не стоят на месте в своих научных изысканиях, удается проводить экспертизы на эффективном новом уровне. К настоящему времени проведено более 100 таких экспертиз по постановлениям 17 областей Украины. Так, в 1999 г. в Крыму злоумышленники убили молодую женщину, обезглавили, череп вываривали в течение 12 часов в котле, после чего покрыли лаком. Остальную часть трупа сожгли. Задача — идентифицировать останки. С таким объектом /в мировой практике/ судмедэкспертизы, использующие ДНК-овый анализ, еще не сталкивались. После внимательного изучения строения костных останков была подобрана методика и выделена ДНК. Далее установление принадлежности останков женщины предполагаемым родителям было делом техники и генетических расчетов с достоверностью 99,99%.

Следователи Одесского региона хорошо знакомы с возможностями Одесских специалистов в области ДНК-ового анализа. Областной прокуратурой проведено 3 семинара, где ДНК-технологиям, как наиболее эффективному методу идентификации личности, уделяется серьезное внимание. Кроме того, правоохранительные органы и других областей Украины обращаются за помощью в Одесское облбюро судмедэкспертизы, в том числе и Запорожская область.

Приведем следующие примеры:

• — На технической площадке одного из домов г. Запорожья обнаружен труп молодой гражданки с признаками насильственной смерти, в содержимом прямой кишки обнаружена сперма. Экспертизой установлено, что ДНК спермы не принадлежит подозреваемому. Результаты позволили последнего исключить.
• — Ярким примером ценности применяемого метода для изобличения преступника является раскрытие зверского убийства малолетней Б., сопряженное с изнасилованием, совершенное средь бела дня в поселке Юрьевского района Днепропетровской области. Среди значительного количества подозреваемых был найден один — ДНК спермы на вещественном доказательстве. Преступник действительно сознался, рассказав о мотивах и способах совершения убийства.

Использование метода генотипоскопии может позволить решить многие проблемы, возникающие при раскрытии и расследовании преступлений.

Метод генотипоскопии в настоящее время очень активно внедряется в практику правоохранительной деятельности и это не дань моде, а следствие его революционных возможностей. С помощью этого метода практически решаются правоохранительные задачи, которые ранее были неразрешимыми. Кроме того, научно подготовлено еще более широкое его использование в решении многообразных задач идентификации личности человека и животных по следам и объектам биологического происхождения. С появлением этого метода наука и практика получили универсальный инструмент групповой и индивидуальной идентификации любых объектов живой природы.