Иммобилизованные ферменты и их применение в пищевых технологиях

Иммобилизация — это прикрепление клеток микроорганизмов или ферментов к нерастворимым носителям.

Иммобилизация клеток может быть естественным процессом или может быть вызвана химическими или физическими способами. Именно развитие методов управления искусственной или индуцированной иммобилизацией привело в настоящее время к осознанию преимуществ применения в биологических реакторах иммобилизованных клеток. Так, при биологической очистке сточных вод долгое время применяли иммобилизованные клетки, распределенные в виде пленки по твердой поверхности капельного биофильтра, и традиционный способ получения уксуса включает применение клеток Acetobacter, иммобилизованных на березовых прутьях. Эти процессы, однако, представляют собой примеры иммобилизации, происходящей естественным путем. В настоящее время стала доступной иммобилизация любых микробных или тканевых клеток, что привело к значительному расширению возможностей их применения. Даже в случае очистки сточных вод последние достижения позволили значительно усовершенствовать этот традиционный процесс, основанный на использовании иммобилизованных клеток, за счет увеличения удельной поверхности насадки в системе.

Клеточная иммобилизация как прокариотических, так и эукариотических клеток позволяет создавать биочастицы любого размера, объема и плотности. Одной из важнейших особенностей процесса клеточной иммобилизации является возможность достижения чрезвычайно высокой концентрации клеток, что, наряду с легкостью отделения иммобилизованных клеток от жидкой фазы, обусловливает ряд преимуществ и способов усовершенствования процесса.

Иммобилизованные клетки остаются в реакторе при непрерывном прохождении жидкой фазы, что позволяет контролировать скорость роста клеток вне зависимости от расхода. Можно легко проводить непрерывный процесс даже с не растущими клетками, что невозможно в случае свободно взвешенных клеток.

Возрастание общей продуктивности. Это является прямым следствием сохраняющейся высокой концентрации клеток в реакторе. Легкое разделение клеток и жидкости. Грубое фильтрование или быстрое осаждение под действием силы тяжести позволяет удалить жидкость из реактора, не удаляя клетки. Повторное культивирование с использованием тех же клеток. Отработанную жидкость можно удалить, а сосуд наполнить свежей средой.

Усиливается массообмен между газовой и жидкой фазами. Иммобилизация разрешает проблему вязкости, часто связанную с высокими концентрациями взвешенных клеток, что позволяет улучшить массообмен.

Методы иммобилизации универсальны для всех видов иммобилизованных биокатализаторов — индивидуальных ферментов, клеток, субклеточных структур, комбинированных препаратов.

Для иммобилизации используются такие ферменты как: Е. Coli, Kluyvervmyces fragilis, К lactis, Aspergillus niger, A oryzae, B. Subtilis, B. licheniformis, B. Thermoproteolyticus, Mucor pusillus.

Наряду с иммобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяется иммобилизации клеток и субклеточных структур: Mucobacterium globiformis, Arthrobacter, Aureobacidium pullulan, Bacillus thermoproteoluticus, Erwinia herbicola, Е. Intermedia, Е. Coli. Это объясняется тем, что при использовании иммобилизованных клеток отпадает необходимость выделения и очистки ферментных препаратов, применение кофакторов; создается возможность получения полиферментных систем, осуществляющих многостадийные непрерывно действующие процессы.

В промышленных процессах чаще используют покоящиеся клетки. Для подавления роста иммобилизованных клеток растений используют дефицит фитогормонов, а рост клетки бактерий тормозят добавлением антибиотиков.

Идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособную форму).

Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечисленным требованиям. Тем не менее, существует широкий набор носителей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

В зависимости от природы носители делятся на органические и неорганические материалы.

Сочетание уникальных каталитических свойств энзимов с преимуществами иммобилизованных ферментов как гетерогенных катализаторов позволило создать новые промышленные технологические процессы. Следует отметить, что все они относятся к производству пищевых продуктов и лекарственных препаратов.

В настоящее время в мире разработаны следующие крупномасштабные производства с использованием иммобилизованных ферментов и клеток:

Получение глюкозофруктозных сиропов.

Получение оптически активных L-аминокислот из их рацемических смесей.

Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония.

Синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты.

Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты.

Получение безлактозного молока.

Получение Сахаров из молочной сыворотки.

Получение 6-аминопенициллановой кислоты.

В качестве примера рассмотрим некоторые из них.

Получение глюкозофруктозных сиропов.

Фруктоза (фруктовый, плодовый или медовый сахар) — важнейший в физиологическом и технологическом отношении природный моносахарид. Превращаясь в печени и кишечнике млекопитающих в глюкозу, фруктоза включается в пластический и энергетический обмен клетки. Она в 2,5 раза слаще глюкозы и в 1,7 раза слаще тростникового сахара (сахароза), благодаря чему фруктоза — менее калорийный пищевой продукт по сравнению с последними. В отличие от глюкозы обмен фруктозы не контролируется инсулином, поэтому фруктовый сахар может потребляться больными диабетом. Фруктоза практически не вызывает кариеса зубов. В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется, поэтому широко используется для производства кондитерских изделий.

Объем производства сахарозы за последние 100 лет возрос в 15 раз и составляет, по разным оценкам, 30 — 40 кг в год на человека. Однако, несмотря на явные преимущества использования фруктозы, первая промышленная установка для превращения глюкозы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы была запущена лишь в 1973 г. (компания «Клинтон Корн», США). Исходным сырьем для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала в присутствии минеральных кислот. Для конструирования промышленного биокатализатора глюкозоизомеразу сорбируют на пористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Во многих случаях используют иммобилизованные клетки разного происхождения (Aspergillus niger, A. oryzae, Streptomyces phaeochrmogenes, S. olivaceus, S. venezuelae). Коммерческие препараты иммобилизованной глюкоизомеразы имеют вид гранул, шариков, волокон или аморфной массы. Наиболее эффективными биореакторами для получения фруктозы признаны аппараты колонного типа высотой около 5 м, в которых по сравнению с реакторами перемешивания расход фермента минимален.

Производительность такого реактора варьирует от 600 до 9000 кг глюкозофруктозного сиропа на 1 кг иммобилизованного фермента в зависимости от чистоты исходного сырья, а время полуинактивации катализатора — 20−50 суток. Возникающий в результате, каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42 -45% фруктозы, около 51% глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы. Эти смеси постепенно вытесняют инвертиро ванный сахар в промышленности и медицине. Глюкозофруктозную смесь широко применяют для производства тонизирующих напитков, консервированных фруктов, кондитерских изделий, хлеба, мороженого и пр. Экономические расчеты показали, что производство глюкозофруктозных сиропов с использованием иммобилизованной глюкоизомеразы в 1,5 раза выгоднее получения сахарозы из сахарной свеклы по традиционной технологии. Благодаря этому обстоятельству производство глюкозофруктозных сиропов в мире постоянно растет. Так, в 1980 г. 10% потребляемого населением Японии сахара заменено на глюкозофруктозную смесь. В США эта доля к началу нового столетия достигла 40%.

Получение L-аспарагиновой кислоты.

Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель и подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из получаемого химическим путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. в Японии (фирма «Танабе Сейяку»); в ней использованы иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки кишечной палочки Е. coli, содержащие аспартат-аммиак-лиазу:

НООС — СН = СН — СООNH4 Аспарат-NH3 -лиаза НООС — СН2 — СН — СООН NH2.

Полиакриламидный гель с иммобилизованными микробными клетками формуют в виде кубиков размером 2 — 3 мм, которыми заполняют колонку объемом 1 м³. Через колонку пропускают раствор фумарата аммония.

При подкислении выходящего из колонки элюата до рН 2,8 и охлаждении до 15 °C из него выкристаллизовывается аспарагиновая кислота в виде препарата 100%-й чистоты. Процесс получения аспартата полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Производительность процесса — 1700 кг чистой аспарагиновой кислоты в сутки на реактор. Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраняют активность фермента на 80% в течение 120 дней и на 50% в течение 600 дней работы реактора, в то время как свободные клетки — всего на протяжении 10 дней с уровнем активности 25% от исходной.

Получение L-аланина.

В настоящее время основной промышленный способ получения L-аланина — ферментативное декарбоксилирование L-аспарагиновой кислоты:

Аспарат-в-декар-боксилаза НООС — СН2 — СН — СООН H3C — CH — COOH + CO2 NH2 NH2.

Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется аспартат-р-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), иммобилизованных в полиакриламидном геле, каррагинане или полиуретане. Разработанная установка производит этим способом 10 т аланина в месяц. Усовершенствование процесса связано с использованием в качестве сырья фумарата аммония. В данном случае процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в двух последовательно расположенных реакционных колонках. На первом этапе фумаратаммония превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной среды на втором этапе претерпевает в-декарбоксилирование с образованием аланина.

С помощью иммобилизованных клеток Serratia marcescens из треонина и глюкозы синтезируют L-изолейцин, а с помощью иммобилизованных клеток Corynebacterium glutamicum — L-глутаминовую кислоту из L-глюкозы; L-триптофан — из индола; L-орнитин — из L-аргинина. Таким образом, расширение производства аминокислот стало возможным благодаря изменению технологии получения промышленных биокатализаторов и снижению затрат при их производстве.

Получение L-яблочной кислоты.

Яблочная кислота — заменитель лимонной в продуктах питания и лекарственных препаратах.

Яблочную кислоту получают, используя иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки, содержащие фумаратгидратазу. В присутствии этого фермента происходит присоединение воды по двойной связи в молекуле фумаровой кислоты:

Фумарат-гилратаза НООС — СН = СН — СООН + НОН НООС — СН2 — СН — СООН ОН В интактных клетках время полуинактивации фумаратгидратазы составляет 6 суток, в иммобилизованных в полиакриламидном геле — 55 суток, а в иммобилизованных в геле на основе каррагинана — 160 суток.