Пространственная динамика свертывания крови

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Обзор современных представлений о свертывании

1.2 Математические модели системы свертывания

Глава 2. Методы

Глава 3. Описание математической модели системы свертывания

3.1 Математическая модель кинетики свертывания в реконструированных системах

3.2 Математическая модель пространственной динамики свертывания в плазме

Глава 4. Исследование математической модели системы свертывания

4.1 Регуляция свертывания ингибитором пути тканевого фактора

4.2 Реакция активации фактора XI тромбином

4.3 Влияние тромбоцитов и фосфолипидов на скорость реакций свертывания

4.4 Влияние кинетических констант реакций свертывания на кинетику системы

Обсуждение результатов

Выводы

Список сокращений

Биохимические и медицинские исследования последних десятилетий привели к значительному прогрессу в изучении ферментативных систем организма. Это в полной мере относится к системе свертывания крови, являющейся частью системы гемостаза, отвечающей за поддержание целостности кровеносной системы при повреждении стенки сосуда [7, 29, 55]. Первичная остановка кровотечения достигается за счет сокращения гладких мышц сосудистых стенок, которое вызывает уменьшение просвета сосуда, и за счет образования рыхлой тромбоцитарной пробки в месте повреждения. Затем срабатывает плазменная система свертывания, приводящая к локальному переходу плазмы крови из жидкого в гелеобразное состояние. В результате образуется прочный сгусток, полностью предотвращающий потерю крови до тех пор, пока не произойдет репарация повреждений.

Несмотря на обилие эмпирической информации об устройстве и функционировании системы гемостаза, наше понимание регуляции этого процесса далеко от ясности. Плазменная система свертывания крови включает десятки различных белков, сложным образом взаимодействующих друг с другом, с эндотелием сосудов и с клетками крови, в первую очередь, тромбоцитами. В свою очередь, тромбоциты могут активироваться под действием разнообразных агентов, выбрасываемых из разрушенных клеток, секретируемых уже активированными тромбоцитами или производимых системой свертывания, что ведет к адгезии активированных тромбоцитов к месту повреждения и агрегации, а также к изменениям в их клеточной мембране, которые позволяют реакциям свертывания происходить на ее поверхности [7, 37]. Наконец, необходимо учитывать, что задача создания локализованного сгустка является принципиально пространственной [1], что еще более усложняет интерпретацию экспериментальных результатов.

Сложность системы гемостаза делает математическое моделирование удобным и эффективным методом ее исследования. Модели могут служить как дополнением к экспериментальным исследованиям, средством для их планирования и объяснения их результатов, так и самостоятельным инструментом для исследования режимов поведения системы свертывания и прослеживания связи между устройством системы и ее функционированием. Несмотря на то, что к настоящему моменту опубликовано более десятка различных моделей каскада свертывания, вследствие интенсивного развития биохимии свертывания схемы реакций, кинетические константы, верификационные данные, которые они используют, в значительной степени устарели. Настоящая работа посвящена построению и исследованию полной математической модели системы свертывания крови, включающей как внутренний, так и внешний пути активации, количественно описывающей существующие гомогенные и пространственные эксперименты.

Задачи исследования

1. Провести анализ литературы и построить количественную модель свертывания крови, отвечающую современным биохимическим представлениям о системе свертывания и описывающую известные на настоящий момент экспериментальные данные по исследованию свертывания in vitro.

2. Исследовать блоки реакций, представления о которых подверглись пересмотру в работах последних лет: блок реакций ингибитора пути тканевого фактора, активация фактора XI тромбином, участие различных типов поверхностей в поддержание реакций свертывания. Оценить их вклады в случаях гомогенной и пространственно неоднородной экспериментальной постановки.

3. Исследовать зависимость поведения системы от изменения кинетических констант реакций и концентраций реагентов.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Обзор современных представлений о свертывании

Во всех многоклеточных организмах, за исключением низших беспозвоночных, не обладающих ни кровью, ни гемолимфой, присутствуют механизмы гемостаза — системы, отвечающей за поддержание целостности повреждении сосудистой системы. У млекопитающих выделяют два основных звена гемостаза: первичный, сосудисто-тромбоцитарный, и вторичный, плазменный гемостаз [7, 37]. При повреждении стенки сосуда первыми срабатывают механизмы вазоконстрикции и образования тромбоцитарной пробки за счет того, что при повреждении эндотелия в кровь попадают вещества, которые вызывают сужение сосудов и активацию тромбоцитов. Будучи активированы, тромбоциты, в норме имеющие форму пластинки, становятся шарообразными и приобретают способность к адгезии к месту повреждения и взаимной агрегации. В результате на месте повреждения образуется сравнительно рыхлая тромбоцитарная пробка, предотвращающая потерю клеток крови, но не плазмы. Характерное время срабатывания этих систем — несколько минут. На фоне этих событий развивается плазменный гемостаз, время срабатывания которого имеет порядок десятков минут. Его работа приводит к образованию плотного фибринового сгустка, полностью предотвращающего потерю крови. Спустя несколько часов вследствие сокращения волокон фибрина происходят дальнейшее уплотнение сгустка, ретракция, и далее, по мере репарации повреждений, лизис тромба.

In vivo все элементы системы гемостаза находятся в тесном взаимодействии. Так, тромбоциты могут быть активированы одним из главных белков системы свертывания, тромбином. В свою очередь, после активации они предоставляют фосфолипидную поверхность, необходимую для прохождения реакций системы свертывания, а также секретируют десятки веществ, воздействующих на все звенья гемостаза, в том числе факторы свертывания V и XI, фактор Виллебрандта, фибриноген и ряд ингибиторов свертывания. Большую роль в регуляции гемостаза играет эндотелий сосуда, тесно взаимодействующий как с тромбоцитарной, так и с плазменной системами гемостаза. Тем не менее, в экспериментах in vitro эти системы могут быть успешно разделены и исследоваться самостоятельно. Поскольку настоящее исследование сосредоточено на моделировании плазменной системы свертывания, она будет далее рассмотрена наиболее подробно. Начало биохимической эпохи исследования свертывания принято связывать с работами Alexander Schmidt и Paul Morawitz [59], которые датируются концом XIX — началом XX в. В них было высказано предположение, что основными этапами свертывания являются превращение неактивного ферментативного предшественника, протромбина, в тромбин под действием некоторого вещества (веществ), условно названного тромбокиназой, с последующим превращением фибриногена в фибрин под действием тромбина. В течение первой половины XX-го века изучение наследственных пороков свертывания и создание клинических тестов, позволяющих количественно охарактеризовать состояние системы свертывания, привели к открытию десятков веществ, участвующих в этом процессе (подробный обзор в [55]). В Таблице 1 приведены концентрации известных на настоящий момент факторов свертывания. В 1964 году в работах MacFarlane и, независимо от него, Davie и Ratnoff схема была усложнена: была предложена парадигма каскада, «водопада» реакций в плазме, ведущих к образованию фибрина, которая является базовой для исследователей в данной области уже на протяжении четырех десятилетий. С тех пор механизм еще более усложнился: единый каскад разделился на две ветви, внутренний и внешний пути активации свертывания, охваченные многочисленными петлями положительных и отрицательных обратных связей и перекрестными взаимодействиями.

Таблица 1. Средние плазменные концентрации основных факторов свертывания (по [55])

В 1949 году Seegers показал [77], что для свертывания необходимо наличие в системе фосфолипидов. Последующие исследования привели к выводу, что почти все реакции свертывания требуют для своего эффективного прохождения наличия отрицательно заряженной фосфолипидной мембраны. Ее могут предоставлять липопротеины плазмы [36], поврежденные фрагменты тканевых клеток [55], мембраны активированных тромбоцитов [99], тромбоцитарные микровезикулы [79], мембраны клеток иммунной системы. Достоверно известно, что в случае некоторых заболеваний эритроциты также могут предоставлять прокоагулянтную поверхность. Есть данные [65], что они могут играть важную роль и в норме, однако это утверждение пока является спорным. Общепринятым же является мнение, что основной вклад в прокоагулянтную активность in vivo в норме вносят тромбоциты [79, 99]. В экспериментах in vivo в качестве прокоагулянтной поверхности часто используют фосфолипидные везикулы из фосфатидилсерина и фосфатидилхолина в соотношении 1:3.

На Рис. 1 приведена упрощенная схема современных представлений о каскаде реакций свертывания. Активация каскада может происходить двумя способами — по внешнему (путь тканевого фактора) или внутреннему пути (путь контактной активации). Внутренний путь активируется при контакте плазмы с чужеродной поверхностью. Классическим активатором in vitro служит стекло. В результате cложной сети реакций с участием XII фактора, высокомолекулярного кининогена и прекалликреина происходит активация XII фактора, который затем активирует фактор XI. Поскольку наблюдаемые в клинике дефициты факторов контактной активации (фактор XII, высокомолекулярный кининоген и прекалликреин) не связаны со склонностью к кровотечениям [55], считается, что физиологически значимым является внешний путь.

Рис. 1. Упрощенная схема реакций системы свертывания. Обозначения схемы: PK, прекалликреин; К, калликреин; HK, высокомолекулярный кининоген; PC, протеин С; TF, тканевый фактор. Суффикс «a» означает активированную форму фермента

В мембранах клеток всех тканей организма (за исключением клеток, находящихся в контакте с кровью — эндотелия сосудов кровеносной системы и форменных элементов крови) присутствует интегральный гликопротеин тканевый фактор (TF). При повреждении эндотелия плазма вступает в контакт с клетками этих тканей, и факторы VII и VIIa, присутствующие в плазме, связываются с TF, образуя комплекс на поверхности мембраны. В норме примерно 1−2% фактора VII, присутствующего в плазме крови, являются активированными. Однако, активный центр свободного фермента не работоспособен, и сам по себе фактор VIIa практически не обладает каталитической активностью, то время как комплекс VIIa-TF способен активировать, путем отщепления небольшого пептида от аминотерминального конца тяжелой цепи, факторы IX и X в активные сериновые протеазы. Фактор Ха, в свою очередь, расщепляет белок протромбин, превращая его в тромбин в очень медленной реакции. Наработанные малые количества тромбина могут активировать факторы VIII и V, которые после активации становятся кофакторами факторов IXа и Ха в реакциях активации фактора X и тромбина, соответственно. Это осуществляется путем образования на фосфолипидной поверхности в присутствии ионов кальция комплексов внутренней теназы IXa-VIIIa и протромбиназы Xa-Va. Эти комплексы способны активировать фактор X и протромбин приблизительно на 3−5 порядков быстрее, чем IXa и Xa, соответственно, сами по себе [72, 84].

Тромбин является центральным ферментом системы свертывания, участвующим в многочисленных реакциях. Главной из них является расщепление белка фибриногена в сложной многоступенчатой реакции с превращением его в фибрин, способный полимеризоваться с образованием разветвленных структур. Попутно, тромбин активирует фактор XIII, который образует поперечные сшивки между молекулами фибрина.

Фактор Xa также может активировать факторы V и VIII, но значительно менее эффективно, нежели тромбин [53, 57]. Физиологическая важность этих реакций пока неясна. Еще одна положительная обратная связь, роль которой сейчас активно обсуждается, — активация тромбином фактора XI [13, 34, 94]. Кроме того, как тромбин, так и фактор Xa способны эффективно активировать фактор VII, превращая его в VIIa.

Для обеспечения устойчивого стационарного неактивированного состояния и для уничтожения активных факторов после завершения свертывания в системе присутствуют многочисленные стехиометрические ингибиторы, которые связываются с активными факторами и ингибируют их деятельность. Ключевыми среди стехиометрических ингибиторов являются антитромбин III и ингибитор пути тканевого фактора, TFPI. Первый из них блокирует активность тромбина, факторов IXa, Xa, XIa, VIIa. Дефицит его приводит к тромбозам. Второй связывается с фактором Xа и внешней теназой, ингибируя обе протеазы и являясь основным регулятором активности комплекса VIIa-TF [22, 69]. Дефицит TFPI в клинике не наблюдался, предположительно, из-за несовместимости с жизнью. Ингибирующее действие TFPI реализуется довольно сложным образом, вовлекая в процесс ингибирования основной продукт работы комплекса VIIa-TF фактор Ха [23, 68]. Более подробно механизм действия TFPI обсуждается в разделе 4.1.

Тромбин также ингибируется кофактором гепарина II и альфа-2-макроглобулином, но в значительно меньшей степени, нежели антитромбином. Некоторый вклад в ингибирование различных протеаз каскада свертывания вносят также альфа1-антитрипсин, С1-ингибитор и ингибитор протеина С.

Каскад охвачен петлей отрицательной обратной связи, так называемым путем протеина С. Будучи активированным тромбином, протеин C инактивирует факторы Vа и VIIIа, резко снижая скорость образования тромбина и фактора Xа соответственно. Кофактором в этом расщеплении служит протеин S, важный антикоагулянт, присутствующий в плазме. Кроме того, что он ускоряет реакции инактивации, он помогает активированному протеину С (PCa) расщепить фактор Va в протромбиназе, чего в его отсутствие не происходит. Кроме того, протеин S обладает независимым от протеина С механизмом антикоагулянтного действия, предположительно, за счет конкуренции с протромбиназой и теназой за место на мембране.

В заключение представляется необходимым упомянуть о влиянии стенок сосудов на свертывающую систему крови, поскольку in vivo оно имеет большое значение. Сосудистая стенка принимает непосредственное участие в регуляции потенциала свертываемости крови. Помимо того, что она служит естественным барьером между кровью и другими тканями, ее клетками синтезируются и/или экспрессируются различные биологически активные вещества, модулирующие тромбообразование. К ним относится фактор Виллебранда, эндотелиальный фактор релаксации (NO), простациклин, тромбомодулин, эндотелин, тканевый фактор, ингибитор пути тканевого фактора и другие. Кроме того, мембраны эндотелиоцитов несут на себе рецепторы, которые при определенных условиях связывают молекулярные лиганды и клетки, свободно циркулирующие в кровотоке. Очень многие аспекты жизнедеятельности этих клеток регулируются тромбином через его взаимодействие со специфическими поверхностными рецепторами. В норме стенки обладают ярко выраженной антитромботической активностью, механизмы которой не вполне ясны. Известно, что с их поверхностью постоянно связано большое количество антитромбина III, а также TFPI, полное содержание последнего на стенках по меньшей мере не уступает пулу плазмы. На поверхности клеток эндотелия содержится трансмембранный белок тромбомодулин, связывающий тромбин и производящий поразительные изменения в его специфичности. В комплексе с тромбомодулином тромбин в сильной степени теряет свои прокоагулянтные свойства, взамен резко возрастает его способность активировать протеин С: скорость активации возрастает на три-четыре порядка.

По всей видимости, перечисленные свойства сосудистой стенки играют важную роль в механизме локализации тромба in vivo.

свертывание кровь модель тромбоцит

1.2 Математические модели системы свертывания

Ограниченность объема данной работы не позволяет подробно осветить все аспекты истории математического моделирования в исследованиях системы свертывания. Поэтому работы, связанные с моделированием отдельных реакций системы или их небольших блоков (такие, как классическая модель протромбиназы [61]), не будут рассматриваться; из моделей, описывающих тромбоцитарный гемостаз, будет рассмотрена только одна [50], поскольку в ней основное внимание уделяется плазменному звену. Главным образом, в настоящем обзоре будут обсуждаться механизменные математические модели системы свертывания, схемы реакций которых включают большую часть каскада свертывания.

Первые математические модели системы свертывания появились сразу же после возникновения представления о ее каскадной структуре. В работе рассматривалась кинетика однородного ферментативного каскада N реакций второго порядка. Активация системы производилась постоянным возмущением первого фактора каскада на протяжении времени a. Каждый из факторов каскада ингибировался в реакции псевдопервого порядка. В работе было показано, что ответ такой системы (кинетика последнего из факторов) должен иметь импульсный вид и быть пропорциональным уровню активации. Начальная кинетика будет степенной, причем показатель степени определяется количеством ступеней каскада.

Последующие исследования обнаружили наличие многочисленных петель положительных и отрицательных обратных связей в каскаде свертывания. В работе была предпринята попытка развить модель [52], дополнив ее учетом роли фибринолиза и адсорбции тромбина на фибрине, как петель отрицательной обратной связи.

Принципиальную роль в истории вопроса сыграла модель [45], в которой рассматривалось влияние петли положительной обратной связи, активации фактора V тромбином, на кинетику системы. Активация и ингибирование факторов свертывания учитывались с помощью кинетики псевдопервого порядка. Основным результатом работы была демонстрация нелинейности ответа такой системы при изменении уровня активации. Подпороговые уровни активации вызывали слабые ответы, в то время как запороговая активация вызывала срабатывание каскада усиления и взрывное формирование фибрина. Такое поведение системы представляется физиологически разумным, предохраняющим организм от образования спонтанных тромбов.

Все перечисленные модели исследовали «абстрактные» системы уравнений, соответсвующие схемам реакций, имеющим лишь отдаленное сходство с системой свертывания. В 1991 г. впервые была предложена количественная модель свертывания [91], в которой использовалась схема реакций, соответствующая биохимическим представлениям того времени, кинетические константы реакций были взяты из литературных данных, а результаты (кинетика тромбина и фактора Va) сопоставлялись с экспериментом. Объектом моделирования являлась рекальцифицированная дефибринированная плазма, в которую были добавлены фосфолипиды в качестве источника поверхности для реакций. Активация системы производилась по внешнему пути. Поскольку устройство начальных реакций свертывания было изучено не очень хорошо, моделировался лишь участок каскада от образования фактора Xa до образования тромбина с учетом активации тромбином фактора V и протеина C. Экспериментально наблюдавшаяся кинетика фактора Xa была аппроксимирована функцией вида

Было показано, что такая система обладает порогом по концентрации фактора Xa (пороговое значение константы, А было 1−10 пМ при б=1 мин^-1). При исследовании влияния констант реакций на порог, было также показано, что скорости инактивации фактора Xa и протромбиназы сильнее влияют на это значение, чем скорости инактивации тромбина или активации протеина С.

Модель [67], как и предыдущая, является количественной. В отличие от [91], однако, в ней рассматривался весь процесс свертывания по внешнему пути — от связывания тканевого фактора с фактором VIIa до образования фибрина. Внутренняя теназа, фактор XI, протеин С в модели не учитывались. Это однако, нельзя считать недостатком, поскольку объектом моделирования был тест протромбинового времени, активация свертывания в разбавленной плазме большими концентрациями тканевого фактора в присутствии избытка кальция. Из клинической практики известно [4], что тест протромбинового времени нечувствителен к колебаниям в концентрациях этих факторов. Неизвестные константы реакций были определены с помощью ч² аппроксимации результатов теста протромбинового времени для больных с различными дефицитами факторов свертывания. Модель была ориентирована на использование для интерпретации клинических данных.

Новый подход к вопросу был продемонстрирован в. Вместо того, чтобы моделировать кровь или плазму, чрезвычайно сложные системы, авторы попробовали количественно описать события, происходящие в системе очищенных белков, включающей основные факторы свертывания — IX, X, V, VIII, II — в плазменных концентрациях, а также фосфолипиды и кальций. Ингибиторов в модели не было. Инициация производилась по внешнему пути добавлением пикомолярных концентраций комплекса TF-VIIa. Для расчетов использовались измеренные экспериментально константы реакций, некоторые из них варьировались, чтобы добиться согласия с результатами эксперимента. Все фермент-субстратные комплексы рассматривались как независимые переменные, для этого скорости их образования были введены в модель искусственно, а скорости диссоциации рассчитаны на основании известных констант Михаэлиса и каталитической. Кроме того, сравнение результатов с экспериментом потребовало от авторов введения искусственной деградации комплекса внутренней теназы, чтобы удержать его концентрацию на уровне не более 3 пМ.

В отличие от моделей [52, 56, 45], эта работа ставила перед собой вполне конкретные, чисто биохимические задачи. Основным результатом является утверждение, что рассмотренных в модели реакций достаточно для описания наблюдаемых в экспериментальной системе закономерностей. В некотором смысле, была подведена черта под представлениями об устройстве основного участка системы свертывания и последовательности событий, происходящих при активации. Кроме того, в работе было показано, что концентрация активатора сильнее влияет на задержку роста тромбина, чем на максимальную скорость, что фактор VIII и внутренний путь в целом становятся важными при малых концентрациях активатора и сильно влияют на кинетику системы после первых 40 сек процесса, что, наконец, фактор Xa и тромбин являются одинаково эффективными активаторами фактора V, но активация фактора VIII тромбином намного важнее, чем активация фактором Xa.

Эта модель была незначительно модифицирована другими авторами в целях клинических исследований с тем, чтобы оценить эффект антитромботической терапии ингибиторами сериновых протеаз. Было показано, что присутствует хорошая корреляция между влиянием препарата на кинетику тромбина в модели и его влиянием на свертывание in vivo у крыс, которым вводили препарат. В качестве показателя состояния системы свертывания in vivo использовался тест активированного частичного тромбопластинового времени. В этом тесте в плазму добавляются большие концентрации фосфолипидов и активатора внутреннего пути и регистрируется время свертывания: тест является стандартным методом мониторинга антикоагулянтной терапии.

Возврат к моделированию «абстрактных» систем на более глубоком уровне произошел в работе. В ней была рассмотрена иерархическая последовательность четырех усложняющих систем реакций, имитирующих систему свертывания. Первая состояла лишь из двух ферментов, взаимно активирующих друг друга, в то время как последняя содержала две последовательные положительные обратные связи, а также так называемую «дальнюю» (long-range) петлю (активация первого фермента каскада последним), имитирующую активацию фактора XI тромбином. Для первых трех систем, поддающихся точному анализу, были определены формулы зависимости порога по активации от констант системы. Последняя из систем исследовалась численно. Для дальней петли наблюдались два эффекта: при высокой скорости она была способна вызвать возбуждение даже при той концентрации активатора, которая иначе была бы подпороговой. При низкой скорости она не влияла на порог, но потенцировала ответ при запороговой активации.

В другой «абстрактной» работе система свертывания была исследована с точки зрения контролируемости и стабильности. Модель основывалась на биохимической схеме реального каскада, однако константы скоростей реакций соответствовали истинным с точностью до порядка-двух. Затем система уравнений была линеаризована и подвергнута анализу. Было показано, что система свертывания неконтролируема в том смысле, что внешние воздействия после активации слабо влияют на ее эволюцию.

Модель была предложена в 1998 г. для описания стандартного клинического теста протромбинового времени. Путь протеина С и активация фактора XI тромбином не рассматривались. Реакции считались подчиняющимися кинетике Михаэлиса-Ментен, образование комплексов теназы и протромбиназы считалось необратимой реакцией, константы реакций были взяты из литературы. Были исследованы кинетика факторов свертывания и чувствительность теста к концентрациям их предшественников. Модель предсказала, что лишь сильные дефициты факторов (<20%) могут быть обнаружены с помощью теста. Сравнение результатов расчетов с результатами экспериментов не проводилось.

Следующая работа из той же лаборатории опиралась на экспериментально полученные параметры реакций, но верификация не проводилась. Рассматривалось свертывание in vivo, в потоке. В модели впервые было введена идея примембранного слоя, внутри которого существует полное перемешивание и идет свертывание. Между слоем и потоком происходит диффузионный обмен веществом. В работе было показано, что поток крови может оказывать воздействие на динамику образования тромба и служить регулятором его роста.

Наиболее обширная и детальная на настоящий момент модель свертывания, включающая свыше 50 дифференциальных уравнений, была предложена в 2001 г. в работе. Модель основывалась на кинетических параметрах, приведенных в литературе или полученных на основании косвенных оценок, но верификация и сравнение с экспериментами не проводились. Как и предыдущая модель, она рассматривала свертывание in vivo и использовала понятие примебранного слоя, в котором происходит настолько эффективное перемешивание, что его можно считать полным и в его пределах использовать обыкновенные дифференциальные уравнения. В отличие от всех предыдущих работ, в вводится детальное описание взаимодействия факторов свертывания с тромбоцитами и активация тромбоцитов. Основные выводы модели: 1) система отвечает пороговым образом на изменение концентрации тромбоцитов, 2) предложен возможный механизм ингибирования тканевого фактора с помощью адгезии тромбоцитов на стенку сосуда.

Несмотря на беспрецедентную детальность, модель имеет серьезные недостатки, которые при отсутствии верификации подвергают сомнению достоверность ее выводов. Модель не включает фибриноген и фибрин и, соответственно, не учитывает тот факт, что значительная доля тромбина связывается с фибрином и фибриногеном. Кроме того, отсутствие конечного продукта, фибрина, не позволяет делать обоснованные выводы о влиянии различных факторов на строение сгустка, но только на кинетику тромбина. Модель также не включает фактор XI, однако его отсутствие в организме приводит к кровотечениям, гемофилии С. Несмотря на то, что в модель включены тромбоциты, механизм их взаимодействия с ферментами каскада не соответствует современным экспериментальным данным: в модели считалось, что каждый активный фактор конкурирует со своим предшественником за специфичное только для этих двух белков место связывания на тромбоците. Однако, хорошо известно [37], что факторы свертывания практически не конкурируют за места связывания (в том числе и со своими предшественниками), имея не более 10−20% общих с другими факторами мест связывания. Единственное исключение — два предшественника, факторы II и X, имеют общее место связывания. Фактор VIII в норме вообще не может садиться на тромбоцит [9], и еще в середине 80-х было показано, что Xa фактор садится не на рецептор, а на предварительно связанный фактор Va 83. Модель включает активацию тромбоцитов как с помощью АДФ, так и с помощью тромбина, но известно что активация АДФ не приводит к появлению прокоагулянтной поверхности.

Все рассмотренные модели были посвящены исследованию гомогенных систем, которые также являются наиболее изученными экспериментально. В то же время, задача образования плотного локализованного фибринового сгустка является принципиально пространственной. В 1994 г. была предложена феноменологическая модель образования сгустка в пространстве [1], в которой было сформулировано автоволновое представление о процессе свертывания. Она включала два уравнения в частных производных. Первая переменная соответствовала условному «активному веществу» (реальный аналог — тромбин), вторая — условному «ингибитору» (протеин С). В модель было введено предположение о существовании автокаталитической наработки ингибитора, что приводило к возникновению двух автоволн, активатора и ингибитора. Волна ингибитора нагоняла волну активатора и останавливала рост тромба. С помощью этой модели был качественно описан ряд наблюдавшихся в эксперименте режимов: образование тромбов фиксированного, не зависящего от активатора размера, образование слоистых тромбов.

Позднее в той же лаборатории была развита количественная модель [11], описывающая гомогенную кинетику свертывания при активации по внутреннему пути. Уникальной особенностью модели был учет зависимости скорости реакций от концентрации кальция. Было показано, что система должна отвечать пороговым образом на изменение концентрации кальция.

Дальнейшему развитию этой модели и исследованию ее поведения в пространстве была посвящена работа. В ней количественно описывается и сравнивается с экспериментом как гомогенная, так и пространственная динамики системы при активации по внутреннему пути. Большая часть констант реакций системы была взята из экспериментальных данных, за исключением нескольких констант, которые не были обнаружены в литературе и варьировались до получения согласия с экспериментом. Инициация свертывания моделировалась постоянным втоком фактора XI с левой границы в пространственном случае и его стационарной концентрацией в гомогенном. В модели была предложена гипотеза о существовании пептида, отщепляемого от протеина С тромбином при активации и переводящего тромбин в антикоагулянтное состояние, идентичное комплексу тромбин-тромбомодулин.

Введение

такого механизма обеспечивало автокаталитическое образование ингибитора и приводило к возникновению ряда режимов, аналогичных. Исследовалось влияние на кинетику констант реакций активации протеина С и фактора XI тромбином. Было показано, что реакция активации фактора XI тромбином при малых скоростях, не влияющих на гомогенную кинетику, может определять пространственную динамику системы. Система уравнений была редуцирована до трех переменных с помощью теоремы Тихонова, обезразмерена и подвергнута детальному исследованию, результаты которого изложены в. Переменными редуцированной модели были тромбин, протеин С и фактор XIa, первые две переменные были автокаталитическими. Было показано существование в такой системе ряда необычных режимов: распространяющийся в пространстве и затем останавливающийся импульс, бегущий импульс с переменной амплитудой.

Несмотря на то, что математическое моделирование процесса свертывания крови имеет длительную историю, на настоящий момент в этой области исследования существуют существенные пробелы. Так, в большинстве работ, рассмотренных выше, проводится лишь качественное исследование моделей; верификация экспериментом проводится лишь в некоторых из них, причем почти всегда для каких-либо искусственных и упрощенных экспериментальных случаев: реконструированная система очищенных белков [43], дефибринированная плазма с добавленными фосфолипидами [91], плазма в тесте протромбинового времени. Несмотря на то, что в организме основным путем активации является внешний, опубликованные модели пространственной динамики рассматривают только внутренний путь. Наконец, успешные экспериментальные исследования последних лет привели к появлению многочисленных новых результатов, изменивших как наши представления о механизмах реакций свертывания, так и численные значения параметров известных ранее реакций, что не нашло пока отражения в модельных работах.

Глава 2. Методы

Численное интегрирование системы обыкновенных дифференциальных уравнений для модели свертывания в системе с перемешиванием производилось вложенным методом Рунге-Кутты-Фельберга порядка 2(3) с помощью специально написанной программы на языке Watcom C++ 10.0. Идея вложенных методов Рунге-Кутты состоит в построении формул, которые давали бы два значения искомой функции в каждой последующей точке: некое приближенное численное значение y и более точное выражение. С помощью последнего можно на каждом шаге управлять погрешностью и длиной шага. Метод Рунге-Кутты-Фельберга 2(3) дает два приближенных решения — второго и третьего порядка точности. Они сравниваются, и, если различие превышает априори заданную точность, шаг уменьшается. Приведем рабочие формулы метода для начальной задачи вида

Они имеют вид:

(1)

где h — шаг метода.

Заданная наперед погрешность е составляла 0.01 в следующей норме:

(2)

При численном интегрировании дифференциальных уравнений в частных производных для пространственной задачи была использована следующая схема. Отрезок длиной L, на котором производилось интегрирование, разбивался на N точек. Для дифференциального уравнения в частных производных вида

(3) использовалась пространственная дискретизация

(4)

Для использовалась аппроксимация Нумерова [8]:

(5)

приводящая к разностной схеме четвертого порядка точности по пространству. Правая часть полученной системы дифференциально — разностных уравнений решалась вложенным методом Рунге-Кутты-Фельберга 2(3).

На границах отрезка были заданы условия не протекания второго порядка для всех переменных, за исключением переменных, соответствующих факторам свертывания, взаимодействующих с факторами на поверхности. Взаимодействие учитывалось следующим образом: пусть переменная отвечает реагенту, взаимодействующему с реагентами на левой стенке сосуда и в объеме в некоторой реакции, такой, что скорость изменения описывается функцией поверхностных переменных и объемных. Тогда граничное условие для имеет вид

(6)

где — коэффициент диффузии фактора, или в дискретном виде

(7)

Для расчета поверхностных переменных также использовался метод Рунге-Кутты-Фельберга 2(3). Используемый численный метод дает второй порядок точности по времени и по пространству.

Задача интегрирования системы уравнений рассматривалась на отрезке прямой длиной L=3 мм, разбитом на 200 точек, заданная погрешность е=0.01 в той же норме, что и для гомогенных систем.

Глава 3. Описание математической модели системы свертывания

3.1 Математическая модель кинетики свертывания в реконструированных системах

Математическая модель гомогенной кинетики свертывания крови представляла собой систему обыкновенных дифференциальных уравнений. Переменными модели были изменяющиеся во времени концентрации факторов свертывания. Дифференциальные уравнения модели были выписаны на основе закона действующих масс. Ферментативные превращения учитывались с помощью справедливой в широком диапазоне концентраций формулы для скорости ферментативной реакции с несколькими субстратами, конкурирующими за один фермент

(8)

где и являются константами, характеризующими превращение j-го субстрата S^j в j-й продукт P^j под действием фермента E в реакции, подчиняющейся кинетике Михаэлиса. Реакции ассоциации, диссоциации и ассоциации с ингибиторами сериновых протеаз (антитромбин III и другие) описывались с помощью кинетики второго, первого и псевдопервого порядка соответственно. Во всех расчетах, если не обозначено иное, начальные концентрации активных факторов (кроме фактора VIIa) были равны нулю, а концентрации неактивных предшественников соответствовали приведенным в Таблице 1.

Ниже приведены уравнения модели, описывающей свертывание в гомогенных системах очищенных белков, имитирующих плазму. Эти реконструированные системы экспериментально исследовались в работах [43, 87, 88]. Результаты этих исследований были использованы для последовательного построения и верификации модели.

Блок реакций внешней теназы

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

Активация факторов IX и X

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

Образование тромбина

(21)

(22)

(23)

Активация кофакторов, факторов VIII и V

(24)

(25)

(26)

(27)

Сборка мембранных комплексов

(28)

(29)

Путь протеина С

(30)

(31)

Антитромбин

(32)

Путь TFPI

(33)

(34)

Если специально не оговорено, кинетические константы реакций модели соответствовали Таблице 2.

Таблица 2. Кинетические константы реакций, входящих в модель гомогенной кинетики свертывания.

В случае, когда приведено несколько различных значений констант, для модели выбирались значения, полученные в условиях, наиболее близких к условиям моделируемых систем (человеческие белки, 37 С, pH 7.4, 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 200 мкМ фосфолипидных везикул из фосфатидилхолина и фосфатидилсерина в соотношении 3:1). Рассмотрим более подробно механизмы отделньых реакций модели и выбор кинетических констант настоящей работы.

Блок реакций внешней теназы

1. Ассоциация фактора VII (VIIa) и TF.

Мы не смогли обнаружить в литературе кинетических констант для ассоциации фактора VII (VIIa) и TF. В ряде работ они были измерены для растворимого TF, не имеющего трансмембранного домена, но известно, что аффинность связывания полноразмерного TF и фактора VIIa отличается на несколько порядков от аффинности растворимого TF. Известно также, что параметры связывания факторов VII и VIIa с TF примерно одинаковы. Поэтому в настоящей работе константы ассоциации фактора VII и TF считались равными константам для VIIa, константа диссоциации была выражена через известное значение равновесной константы диссоциации K_d и константы ассоциации, а было найдено с помощью варьирования (Рис. 2).

Рис. 2. Активация 500 нМ фактора X добавлением 1.25 пМ TF и 100 пМ VIIa в присутствии (?) и в отсутствие (¦) фактора VII (10 нМ).

Константа = 0.01 мин^-1 была подобрана варьированием с помощью данного графика. Остальные константы соответствуют Таблице 2. Экспериментальные данные взяты из работы.

2. Реакции активации фактора VII.

Фактор VII может активироваться факторами Xa, VIIa-TF, IXa и IIa. При этом фактор Xa на порядки эффективнее остальных активаторов (=84 мин^-1, =3200 нМ; =19.2 мин^-1, =1700 нМ, данные для тромбина и фактора Xa приведены в Таблице 2). Однако, в более поздней работе было показано, что тромбин также может играть заметную роль в активации фактора VII, предположительно, в силу его высоких концентраций в системе.

Предварительные расчеты (данные не показаны) показали, что скорость активации фактора VII фактором IXa и VIIa-TF пренебрежимо мала, поэтому в модели учитывается только активация фактора VII тромбином и Xa.

В системе свертывания активность многих ферментов распределена между несколькими субстратами. В особенности это касается тромбина, который активирует факторы VIII, V, VII, XI, протеин С в реконструированных системах, а в крови также факторы I, XIII и тромбоциты. Вообще говоря, для скорости реакции активации фактора VII тромбином в реконструированных системах справедлива формула

(35)

которая учитывает конкуренцию между всеми субстратами за фермент и возможность того, что концентрация субстрата может быть меньше концентрации фермента. Однако, при существующих значениях констант реакций, входящих в формулу, можно пренебречь практически всеми величинами в этой формуле с точностью, не уступающей точности исходной формулы. При этом формула упрощается до

(36)

То же приближение использовано для реакций активации перечисленных выше субстратов тромбина.

Те же рассуждения применимы к другому ферменту с многочисленными субстратами, фактору Xa. Однако, в отличие от тромбина, концентрации фактора Xa очень малы по сравнению с константой Михаэлиса. Поэтому выражение для активации фактора VII фактором Xa имеет вид

(37)

где второе слагаемое в знаменателе учитывает, что значительная часть фактора Xa оккупирована в фермент-субстратном комплексе с протромбином.

Активация факторов IX и X.

1. Ассоциация VIIa-TF и IX, X.

Как описано ниже в разделе 4.1, посвященном пути TFPI, мы были вынуждены ввести дополнительные гипотетические реакции, чтобы описать эффект TFPI. Для этого мы рассматривали комплексы X-VIIa-TF, IX-VIIa-TF и Xa-VIIa-TF как отдельные переменные, в отличие от всех остальных фермент-субстратных комплексов модели, которые исходно были редуцированы. Мы не смогли обнаружить в литературе кинетических констант для сборки фермент-субстратных комплексов внешней теназы. В модели их ассоциация считалась быстрой (5 нМ^-1мин^-1) на основании [43], а константа диссоциации рассчитывалась из, .

2. Активация факторов IX и X внешней теназой.

Литературные данные для констант активации этих факторов дают значения, довольно сильно различающиеся между собой (см. Таблицу 2). Наиболее вероятной причиной расхождения представляется нелинейная зависимость параметров этих реакций от концентрации фосфолипидов и использование различными авторами различных источников тканевого фактора и разной степени его очистки. Сравнение результатов работ и показало, что тканевый фактор моделируемых работ по очищенным системам [43, 87, 88], по-видимому, содержит около 18% активности. Поэтому для расчетов были взяты кинетические константы, указанные в Таблице 2, а концентрации тканевого фактора, взятые в эксперименте, уменьшались в 6 раз.

3. Активация фактора IX фактором XIa.

Кинетические константы реакции была взяты из экспериментальных данных работы и не варьировались.

4. Активация фактора X фактором IXa и внутренней теназой.

Выбор кинетических констант для внутренней теназы подробно рассмотрен в разделе 4.3.

Образование тромбина.

Превращение протромбина в тромбин требует последовательного расщепления двух пептидных связей. В зависимости от порядка расщепления, образуются два различных промежуточных продукта, каталитически активный мезотромбин и неактивный претромбин 2. В очищенных системах первый образуется в основном при активации фактором Xa, второй — при активации комплексом Xa-Va, в крови мезотромбин практически не образуется. Мезотромбин обладает отличной от тромбина активностью по отношению к различным естественным субстратам (см. Таблицу 1) и способен расщеплять субстрат Spectrozyme TH с каталитической активностью на 20% большей, чем тромбин [43], поэтому в экспериментах по очищенным системам, строго говоря, наблюдается не тромбин, а. Константы для различных этапов активации тромбина измерены в немногочисленных работах в условиях, сильно отличающихся от условий в моделируемых системах. Поэтому константы, указанные в Таблице 2, были получены с помощью косвенных оценок, на основании работ [72, 82]. Чтобы описать активацию II и mIIa протромбиназой, мы использовали схему Рис. 3.

Рис. 3. Активация фактора II протромбиназой

Реакция требует двух последовательных расщеплений молекулы фактора II, при этом может образовываться промежуточный продукт, мезотромбин, где Е означает комплекс Xa-Va. На ее основании стандартным образом, как при выводе формул кинетики Михаэлиса-Ментен, были получены использованные в модели формулы

(38)

(39)

(40)

Реакции активации и инактивации кофакторов, факторов VIII и V.

1. Активация факторов V и VIII.

Для описания активации факторов V и VIII тромбином использовались константы (см. Таблицу 2), взятые из экспериментальных работ. Константы для фактора VIII были получены на свиных белках. Поскольку активация свиного фактора VIII включает расщепление трех пептидных связей, для описания реакции в целом были взяты константы для наиболее медленной стадии. Активация фактора V мезотромбином считалась протекающей в 5 раз быстрее, чем активация тромбином на основании. Данных по активации фактора VIII мезотромбином не было обнаружено, но в силу гомологичности факторов VIII и V в модели предполагалось, что она протекает с той же скоростью, что и активация тромбином.

2. Инактивация фактора VIII.

Известно, что фактор VIII быстро инактивируется в плазме, предположительно, за счет диссоциации на субъединицы. Константа его инактивации была взята из работы.

Сборка мембранных комплексов внутренней теназы и протромбиназы.

Реакции сборки ферментативных комплексов протекают в несколько этапов. Компоненты комплекса должны сесть на мембрану и провзаимодействовать на ней. При этом, по-видимому, лимитирующей по скорости стадией является стадия посадки на мембрану. Однако, поскольку большая часть факторов свертывания постоянно связана с мембраной, для скорости сборки комплекса протромбиназы константа ассоциации факторов Xa и Va была оценена по данным для константы ассоциации на поверхности мембраны, а константа обратной реакции была рассчитана из равновесной константы диссоциации.

Для похожего во многих отношениях на протромбиназу комплекса внутренней теназы кинетических констант в литературе обнаружено не было, а наблюдаемая равновесная константа диссоциации близка к равновесной константе диссоциации протромбиназы (см. Таблицу 2). Поэтому для ассоциации факторов VIIIa и IXa были выбраны те же значения кинетических параметров, что и для Xa и Va.