Прогестерон и прогестагены

В 1924 году Кнаус (цит. по А. В. Немилову), наблюдал подавление половой цикличности самок крыс при введении им экстрактов из желтых тел в течение 1,5 месяцев. При этом в яичниках развивались фолликулы, но они не могли овулировать. После прекращения инъекций экстрактов у крыс наступала беременность. Опыты показали, что продолжительность полового цикла зависит от функции желтых тел. В I930 году из желтых тел яичников свиней был выделен и химически идентифицирован секретируемый этой железой гормон, названый прогестероном.

По данным Niswender G. D. et al., (1985) большая часть прогестерона (80%) секретируется в крупных клетках желтого тела, которые занимают приблизительно 40% объема ЖТ (O, Shea J. D. et al., 1989).

По химическому строению прогестерон представляет собой ненасыщенный 3,20 дикстон, образующийся из холестерина. В желтом теле, плаценте и коре надпочечников из холестерина образуется промежуточное соединение — прегненолон, который под воздействием ферментов превращается в прогестерон. Его концентрация начинает увеличиваться с 4-го дня полового цикла, достигая своего пика на 8-й день и сохраняясь на этом уровне до 17-го дня и резко снижается до базального уровня перед следующим эструсом и овуляцией.

Sneeman J. M. и Gosling J. (1975) радиоиммунологическим методом обнаружили в плазме периферической крови у нормально циркулирующих телок минимальный уровень прогестерона в первые 2−4 дня полового цикла, на 10−16 день цикла концентрация прогестерона в крови быстро поднималась, а за четыре дня до наступления течки — резко падала.

Концентрация прогестерона у неоплодотворенных коров колеблется от минимума в эстральной фазе 0, 1 — 0,5 нг/мл и достигает максимума 4 — нг/мл на 10−16 день после овуляции (Степанов Г., 1983; Castellonos R. et al., 1983; Mares E.S. et al., 1962; Peters A. et al., 1983; Pichova В., 1981; Terblanche H., Labuschagne J.- 1981; Vaca L. A. et al., 1983).

Dobeli M. при радиоиммунологическом исследовании динамики прогестерона в циркулирующей крови установил, что до формирования в яичнике желтого тела концентрация прогестерона в плазме крови ничтожна и колеблется в пределах 100 — 500 пг/мл., после формирования желтого тела концентрация прогестерона в плазме крови КРС постепенно повышается до 7−9 нг/мл и остается на этом уровне до 270-го дня стельности, а затем постепенно снижается к отелу до исходного уровня (Dobeli M., 1974). Воздействие высоких концентраций прогестерона через отрицательную обратную связь тормозит выделение ЛГ. Когда желтое тело начинает регрессировать, частота импульсов ЛГ возрастает. Этот процесс происходит в результате увеличения уровня эстрадиола, который стимулирует подъем концентрации ЛГ. Прогестерон во время лютеальной фазы выделяется импульсами, и это показывает его прямую связь с импульсным выделением ФСГ из передней доли гипофиза. (Walters D. L. and Schallenberger E., 1984).

Концентрация прогестерона в плазме крови прямо связана с активностью желтого тела, она является точным показателем состояния овариальной функции и используется для диагностики стельности, эстральных циклов и послеотельной овариальной активности. Абсорбцию прогестерона молочными железами установили у нескольких видов животных (Heap R. B. et al., 1976). Концентрация прогестерона в молоке прямо связана с концентрацией в плазме крови.

Метод РИА прогестерона в молоке использовался для установления состояния овариальной функции (Bulman D. C., Lamming G. E., 1978). Изучение профилей прогестерона в молоке взятых в течение двух или трех недель после отела используются для установления овариальной активности у послеотельных молочных коров. Определенное время после отела, уровень прогестерона в молоке сохраняется на базальном уровне.

Примерно у 50 процентов коров наступающее после этого увеличение концентрации прогестерона короче по продолжительности, чем во время нормального полового цикла. Есть много предположений относительно источника и важности этого кратковременного подъема в концентрации прогестерона. Предполагали, что этот прогестерон секретируется неовулировавшими овариальными фолликулами, которые подверглись лютеолизации или нормальное желтое тело, которое не способно полноценно ответить на лютеотропные стимулы ЛГ. Однако некоторые исследования показывают, что это увеличение концентрации прогестерона предшествует овуляции и что выделение простагландина F2 из матки приводит к неполноценному лютеальному циклу (Hanzen C., 1986; Copelin J. P. et al., 1989). Возможность функционирования этого первого укороченного лютеального периода обеспечивают гонадотропины секретируемые как в нормальный половой цикл.

Проявление охоты редко наблюдается перед первым повышением уровня прогестерона у молочных коров, но обычно регистрируется в последующие половые циклы (Oddе K. G., 1980). В исследованиях Ноттингемского университета на молочных и мясных коровах наблюдали оплодотворение перед повышением концентрации прогестерона в молоке.

Таким образом, проявление охоты и овуляция могут предшествовать послеотельному повышению в концентрации прогестерона, но низкий уровень прогестерона у коров может быть причиной удлинения послеотельного периода (Stupnicki R. et al., 1986).

Как крупные, так и мелкие лютеальные клетки, по-видимому, чувствительны к воздействию ЛГ и, кроме того крупные лютеальные клетки чувствительны к влиянию простагландина Е2 (Schwall R. H. et al., 1986).

Прогестерон и эстрогены оказывают центральное и периферическое действие. При центральном действии эстрогены оказывают влияние на центры гипоталамуса, регулирующие гонадотропную функцию гипофиза, в комплексе с прогестероном оказывают сильное воздействие на выделение ЛГ из гипофиза перед овуляцией (Савченко О. Н., 1967). В результате у животного наступает половое возбуждение. Периферическое действие эстрогенов приводит к увеличению матки, пролиферации и ороговению эпителия влагалища, усилению отделения слизи эндометрием, создает благоприятные условия для продвижения спермиев по половым путям.

Прогестерон создает условия для имплантации бластоцисты и дальнейшего развития зародыша (Клинский Ю. Д., 1970). Воздействуя на гипоталамус, он оказывает ингибирующее влияние на выделение ЛГ из гипофиза (Эскин, 1968), не влияя на секрецию ФСГ; сенсибилизирует нервные половые центры, увеличивая их чувствительность к эстрогенам. Кроме того, он оказывает общее действие на организм, влияя на белковый, минеральный и водный обмены.

В соответствии с открытым М. М. Завадовским принципом «плюс — минус» взаимодействия, яичники не только испытывают стимулирующее влияние со стороны гипофиза, но и в свою очередь сами могут усилить (в малых дозах) или тормозить (в больших дозах) секрецию гонадотропинов (Клинский Ю. Д., 1981). Благодаря обратному тормозящему действию гормона желтого тела — прогестерона становится возможным регулирование циклической секреции гонадотропинов.

Введение

прогестерона в организм или секреция его желтым телом подавляет циклическую секрецию гипофизарных гонадотропинов, необходимых для овуляции. Однако овулирующие количества гонадотропинов выделяются немедленно, как только прекращается поступление прогестерона в организм, что приводит к предовуляторному росту фолликулов и овуляции.

Основываясь на этом, были подготовлены теоретические предпосылки для разработки гормональных методов регуляции половой функции путем изменения продолжительности лютеальной стадии полового цикла с помощью применения стероидов с прогестагенным действием. В 1948 году были проведены первые исследования по контролированию половой функции у овец (Dutt R. H., Casida L. E., 1948) и коров (Christian R. E., Casida L. E., 1948). После четырнадцатидневных инъекций прогестерона 80 — 90% животных проявляли охоту в течение 4-х дней с третьего по седьмой день после прекращения обработки гормоном (Dutt R. H., Casida L. E., 1948). Такие методы синхронизации половой активности животных оказались перспективными для практического животноводства и разрабатывались очень интенсивно во многих странах (Hawk H. W., Conley H. H., 1972). Однако трудоемкость ежедневных инъекций прогестерона в течение 14 — 18 дней ограничивала реализацию возможностей этого метода.

Продолжительность введения прогестерона в организм связана с длительностью лютеальной фазы полового цикла. В случае фронтального применения прогестерона продолжительность обработки должна быть достаточной для того, чтобы у животных, у которых начало обработки совпало с началом естественной лютеальной фазы регрессия желтого тела произошла одновременно с прекращением обработки. Только в этом случае существует возможностъ проявления охоты всеми животными после прекращения введения прогестерона в организм.

Ежедневная оптимальная доза прогестерона для торможения охоты и овуляции у коров, по данным различных исследователей колеблется от 12,5 мг (Ulberg L. C., Lindley C. E., 1960) до 50−60 мг (Avery I. L. et al., 1962). Однако следует, видимо, отдать предпочтение более высокой дозировке, так как отмечалось (Ulberg L. C. et al., I96I), что после введения 12,5 мг прогестерона происходило переразвитие фолликула.

Введение

с кормом требует таких веществ, которые способны всасываться в желудочно-кишечном тракте без изменений. Прогестерон сам по себе инактивируется в желудочно-кишечном тракте и такие синтетические аналоги как, например, медоксипрогестерон ацетат (МАП), меленгестрол ацетат (МГА) были созданы с целью орального применения (Patterson D. J. et al., I989).

Группой отечественных исследователей (Гриненко Г. С. и др., 1977) были произведены некоторые модификации молекулы прогестерона и его производных с целью получения прогестагенов с высокой биологической активностью при оральном применении. Так введение в шестое положение двойной связи сопровождается получением высокоактивного гестагенного препарата, ацетата мегестрола (АЦМ). Минимальная эффективная доза АЦМ, по тесту Клауберга, вызывающая 50%-ный эффект при оральном введении, составила 0,5 мг.

В результате восстановления 3-кетогруппы в гидроксильную получили новый препарат, 17-ацетат мепрегенола или амол, который в 5 раз более активен, чем АЦМ.

Введение

ацетатной группы в 3-е положение позволяет получить другое прогестагенное соединение, мепрегенола диацетат или диамол, с двое большей активностью, чем АЦМ.

Широкому испытанию путем дачи с кормом крупному рогатому скоту были подвергнуты АЦМ, амол и диамол (Клинский Ю. Д. и др., 1977; Смирнов Л. А., Даровских В. Е., 1981; Смирнов Л. А., Балин В. А., 1981).

Большинство прогестагенов синтезировано на основе молекулы прогестерона. Производные прогестерона имеют у семнадцатого атома углерода вторую ацетатную группу, защищающую от разрушения в желудочно-кишечном тракте (Клинский Ю. Д., Даровских В. Е., 1984). Специфическая прогестагенная активность значительно повышается после присоединения к 16-му атому углерода группы СН2 (оксипрогестерон), а также после присоединения к 6-му атому углерода метильной группы (амол, диамол) или атома хлора (хлормадинон). После одновременного присоединения СН2 — группы к 16-му атому углерода, метильной группы к 6-му атому углерода и восстановления двойной связи получено соединение (ацетат меленгестрола), которое в 200 раз активнее прогестерона. На основе тестостерона были синтезированы стероиды с прогестагенным действием: норэтинодрел, норгестрел и другие (Корхов В. В., 1979).

Синтезированные на основе прогестерона и тестостерона соединения обладали разным физиологическим действием. Препараты могут иметь определенную эстрогенную или андрогенную активность, а также иметь разную скорость метаболизма в организме животных (Корхов В. В., 1979). Поэтому далеко не все из испытанных прогестагенных препаратов оказались пригодными для синхронизации половой функции сельскохозяйственных животных.

Биологические особенности прогестагенных препаратов наиболее полно изучены на овцах, в опытах Shelton I. N. и Robinson T. I. (1967) были испытаны 7 прогестагенов, синтезированных на основе модификации молекулы прогестерона, на 228 нормально циклирующих овцах по способности тормозить проявление охоты и овуляции, а также вызывать охоту после прекращения введения препарата. Было выяснено, что все прогестагены, за исключением одного SС -11 800, подавляли охоту и овуляцию. Однако после прекращения обработки овец прогестагенами SC-10 230 и SC-100I7 не проявлялся эффект синхронизации, отсутствие которого авторы объясняют медленным метаболизмом данных препаратов и накапливанием их в организме. Физиологичское влияние только одного из испытанных прогестагенов, а именно SC-9880, соответствовало физиологическому действию прогестерона с той разницей, что он был в 2,5 раза активнее прогестерона и сохранял прогестагенную активность под влиянием пищеварительных ферментов, поэтому данный прогестаген получил распространение во всем мире для контролирования половой функции овец и крупного рогатого скота. Он известен как кронолон или флуорогестон. Овуляция происходила через 29 — 53 часа после прекращения обработки прогестагеном.

Несколько десятков прогестагенных препаратов было испытано на телках с целью синхронизации половой функции (Hansel W., 1967; Menge A. C., Christian J. J., 1968; Wishort D. F., 1977). Но распространение получили лишь несколько прогестагенов для применения в скотоводстве: медроксипрогестерон (провера), хлормадинон, меленгестрол, мегестрол, кронолон.

В опытах Хансела изучено применение провера и хлормадинона у мясных и молочных телок (Hansel W., 1967). В опытах на молочных телках после применения провера в дозах 500 — 900 мг в день в течение 20 дней синхронно проявили охоту 45% телок. Наибольшая степень синхронизации охоты получена при скармливании 200 мг провера и 10 — 12 мг хлормадинона в течение 18 дней: 58% телок синхронно пришли в охоту, из них стали стельными в синхронизированную охоту 56% животных. У животных со спонтанной охотой, не получавших гормонов, оплодотворяемость составила 65% (Marahall D. F. J., Struthers G. A., 1978; Gordon I., 1975;).

В опытах Chakraborty P. K. и др. (1977) меленгестрол скармливали в течение 14 дней в дозе 1 мг. В период дачи прогестагена животные не проявляли половую активность, а на 3−5-й дни после последней дачи препарата 90% телок проявили охоту. Однако, из 12 осемененных телок стельность наступила только у одной (8%) тогда как в контроле (не обработанные прогестероном телки) из 12 осемененных стельность наступила у 7 (58%).

Kordts E. и др. (1974) предложили с 15 по 35 день после отела клинически здоровым коровам ежедневно скармливать по 10 мг хлормадинацетата. В результате, в течение 4-х лет отмечено более раннее возобновление циклической активности яичников, сокращение периода между отелами (в среднем на 10,5 дней) и снижение бесплодия. Есть сообщения об успешном применении других прогестагенных препаратов, в частности, меленгестролацетата (Вrаnnen L. R. et al, 1977).

Оральное введение прогестагенов имеет ряд недостатков, связанных с неудобством дозировки препарата, трудоемкостью ежедневного введения в корм и затрудненным контролем за обработкой.

Кроме того, было установлено, что длительная обработка прогестероном приводит к уменьшению процента стельности ввиду неблагоприятных изменений во внутривлагалищной среде, которая затрудняет транспорт спермы (Smith J. F., Allison A. J., 1971), снижает число сокращений миометрия в направлении яйцеводов (Hawk H. W., Есhternkamp S. E., 1973). У ряда животных не сразу понижался уровень прогестерона в крови, возможно, из-за накопления экзогенного гестагена в организме, что также приводило к снижению оплодотворяемости (Hansel W. et al, 1978).

Выше перечисленные причины побудили к поиску других способов введения прогестагенов в организм. Норгестомет является одним из синтетических аналогов прогестерона, его вводят с подкожными силастиковами имплантантами. Имплантант помещают под кожу уха на 9 дней. Во время имплантации делают внутримышечную инъекцию 5 мг эстрадиола валериата, действующего как лютеолизин, в комбинации с введением 3 мг норгестомета (Mauleon P., 1974; Wiltbank J. N., Gonzalez-Padilla E., 1975).

Имплантанты норгестомета также используют в комбинации с ПГ F2 (De La Sota R. L. et at., 1993). За рубежом широкое распространение получила схема для синхронизации и стимуляции охоты «Synchrо-Mate B», включающая комбинированное применение ушного имплантанта норгестомета (6 мг) и после его удаления на девятый день введение 5 мг эстрадиола валериата. Приход в охоту при этом колеблется от 77 до 100% при оплодотворяемости от 33 до 68% (Wiltbank J. N. and Gonzalez-Padilla E., 1975; Odde K. G., 1990).

Интересно использование внутривагинального устройства выделяющего прогестерон (ПРИД) (Roche J. F., 1975; Webel S. K., 1976). ПРИД оставляется и находится внутри влагалища коровы в течение 7−12 дней. Он представляет собой спираль из нержавеющей стали, покрытую слоем инертного силастика, который пропитан 1,55 мг прогестерона. Желатиновая капсула, содержащая 10 мг эстрадиола бензоата помещена с внутренней стороны спирали ПРИД. Эстрадиол бензоат в желатиновой капсуле быстро всасывается через стенку влагалища в кровь и воздействует как лютеолитическое вещество. Прогестерон выделяется из силастика в течение всего периода обработки.

Удаление устройства через 7−12 дней приводит к падению концентрации прогестерона, как при естественном лютеолизе, и корова приходит в охоту 48−72 часами позже и осеменяется в фиксированное время.

В настоящее время для интравагинального введения прогестерона используются устройства, состоящие из нейлонового основания и силиконового эластомера включающего в себя 1,9 г прогестерона. (Macmillan K. L., Peterson A. J., 1993).

Lynch P. R. et al. (1999) добивались повышения оплодотворяемости используя интравагинальные введения прогестерона в течении 10 дней начиная со второго — третьего дня полового цикла в комбинации с инъекцией Гн-РГ на 12 — 13 день.

Применение внутривлагалищных устройств имеет свои неудобства, связанные с трудоемкостью введения и удаления. Кроме того, часть животных теряет эти устройства, что снижает эффективность их применения.

В связи с этим, возникла необходимость поиска других способов его введения в организм и создания синтетических препаратов со сходными свойствами. Хорошие результаты были получены при внутримышечном и подкожном введении различных прогестагенов.

В научно-производственных опытах Bush W. и др., (1972) изучалось применение хлормадинона на 4100 половозрелых телках. Хлормадинон вводили животным в масляном растворе в дозе 20 мг в течение 18 дней. В период дачи прогестагена проявления охоты у животных не наблюдали, а на 4 — 5-й день после прекращения дачи препарата у всех телок отмечена охота, а в течение 5 — 7-го дней происходила овуляция, которую выявили ректальной пальпацией яичников. Оплодотворяемость составила в среднем 60%.

Исследователи пытались удлинить действие прогестерона и его производных, используя различные пролонгаторы. В экспериментах Wagner J. F. и др. (I960) в масляный раствор прогестерона добавляли 0,3%-ный раствор крахмала, что увеличивало время всасывания гормона на 13−18 суток.

Логинова Н.В. и др. (1966) установили, что добавка к 2%-ному масляному раствору прогестерона сыворотки крови овец или коровьего молока удлиняет период всасывания гормона до 6-дней.

В нашей стране синтезированы прогестагены, которые при парентеральном введении обладают пролонгированным действием, например, 17-КОП, диамол (Прокофьев М. И., 1983).

Продление действия стероидных производных осуществляется превращением (ацетилированием) гидроксистероидов в эфиры жирных кислот (уксусной и особенно капроновой). Препараты этого типа проявляют прогестагенное действие в течение 10 или более суток после однократного парентерального введения. Это позволяет вводить их более редко.

Например, в опытах Прокофьева М. И. (1977) был испытан 17- оксипрогестерон-капронат (17-КОП), которым можно вызывать удовлетворительную синхронизацию охоты путем однократного парентерального введения 1500 мг препарата. Им был предложен для практического применения метод контролирования половой функции основанный на однократном подкожном введении эмульсии оксипрогестерона капроната. Эмульсия создает в месте инъекции депо прогестагена, который медленно всасываясь ингибирует циклическую секрецию гонадотропинов и предотвращает овуляцию в течение 12−17 дней после инъекций.

Применение прогестерона создает эффект лютеальной фазы полового цикла (Ramirez-Godinez J. A. et al, 1981) и вызывает изменение частоты импульсов ЛГ способствующее сохранению фолликулов (Bergfeld E. G. et al., 1996; Taft R. A. et al., 1996). Вместе с тем, методы регуляции половой функции только с помощью прогестагенов имели существенный недостаток, после осеменения в синхронизированную охоту наблюдали значительные изменения оплодотворяемости (Hansel W., 1967). Как правило, в синхронизированную охоту беременными становилось на 10 — 15% животных меньше, чем в спонтанную.

Применение прогестагенов для индуцирования овуляции после отела приводило к различным результатам. Некоторые авторы сообщали о задержке наступления овариальных циклов, а у других применение прогестагенов, с или без эстрогенов, сокращали период до первой овуляции. Однако оплодотворяемость в индуцированный эструс была неизменно ниже, чем в спонтанную (Foote, Hunter, 1964; Saiduddin S. et al., 1968; Patterson D. J. et al., 1989).