Определение подлинности и доброкачественности надземной части растений L. gmelinii. 
Разработка АНД и его представление в НЦЭЛС МЗ РК

Определение подлинности, т. е. тождественности исследуемого вида сырья достигается такими показателями как макроскопия и микроскопия, а также некоторыми качественными реакциями на определение классов органических соединений, преобладающих в исследуемом растении.

Макроскопия. Кермек Гмелина представляет собой дикорастущее многолетнее травянистое растение 30−80 см высотой. Стебель — прямой, укороченный в верхней части, с двумя немногими, обычно парными ветвями с широкой щитковидной верхушечной метелкой. Листья-розетки многочисленные, зеленые или сизовато-зеленые, на изломах краснеющие, от продолговато-обратнояйцевидных до широкоэлептических. Цветоносы один или несколько, верхушечные или пазушные. Цветки в мелких, 1−3-4-цветковых колосьях-полузавитках, образующих почти щитковидные или пирамидальные соцветия. Колоски 4−5-6 мм длиной, чашечка 4−4,5 мм длиной, при основании и до половины по жилкам, иногда по двум внутренним жилкам густо и довольно длинно опущенная. Отгиб беловатый или бледно-фиолетовый, 5 реже 10 зубчатый. Лепестки сине-фиолетовые, редко белые. Семена удлиненно-яйцевидные, 2 мм длиной, 0,6 мм шириной, темно-пурпуро-коричневые. Цветет в июне-сентябре, плодоносит в августе-сентябре [1−3, 5−10].

Микроскопия. Листовая пластинка снаружи покрыта эпидермисом. Клетки эпидермиса плотносомкнуты, без межклетников. Клетки верхнего и нижнего эпидермиса покрыты мелко-бугорчатой кутикулой. Лист дорзивентральный, с 2-рядной плотно сомкнутой хорошо развитой палисадной тканью, расположенной на верхней, адаксиальной стороне. Губчатая ткань рыхлая, состоит из клеток разнообразной формы, вытянутых по ширине листа и лежащих в плоскости, параллельной поверхности листа (рисунок 4).

Рисунок 5 — Верхний эпидермис листа (х 760) 1 — устьичный аппарат, 2 — основания трихом.

Сосудисто-волокнистые пучки пронизывают мезофилл листа. Тип проводящего пучка коллатеральный. Субэпидермальная уголковая колленхима 3-рядная над жилкой, 4-рядная под ней. Эпидерма с обеих сторон имеет почти одинаковое строение и состоит из небольших клеток, многоугольных в очертании. Устьица многочисленны с обоих сторон, они окружены 2−3, реже 4 клетками эпидермиса. Волоски в значительном количестве по всей поверхности листа одноклеточные, слегка изогнутые с заостренной верхушкой и грубобородавчатой поверхностью. Часто волоски отпадают и тогда на месте прикрепления волоска остается маленький круглый валик, окруженный розеткой клеток эпидермиса (рисунки 5,6). Все жилки листочка имеют паренхимную обкладку.

Рисунок 6 — Нижний эпидермис листа (х 760)(х 180) 1 — устьица, 2 — основания трихом

Рисунок 7 — Анатомическое строение молодого стебля (х 180) 1-эпидермис, 2- первичная кора, 3- слеренхима, 4- проводящий пучок Паренхима.

Стебель покрыт эпидермой, состоящей из табличатых клеток, внешние стенки эпидермы имеют мелкобугорчатую кутикулу (рисунки 7,8). Глубже расположен слой паренхимы первичной коры, резко отграниченной от центрального цилиндра группами клеток склеренхимы.

В первичной коре развиты два слоя. Первый слой стебля состоит из ассимиляционной ткани с содержанием хлорофилла, клетки более вытянутые и расположены перпендикулярно эпидерме (рисунок 9).

Рисунок 9 — Анатомическое строение стебля постгенеративной фазы (х 180) 1-эпидермис, 2-ассимиляционная ткань, 3-паренхимные клетки первичной коры, 4- склеренхима, 5- флоэма, 6- ксилема.

Они являются важным диагностическим признаком. Хлорофиллоносная паренхима более развита у молодых растений. Второй слой содержит паренхимные клетки различной формы. Склеренхимные клетки толстостенные, в поперечном сечении округлые, с точечной полостью. В зоне склеренхимных клеток некоторые примыкающие клетки коры содержат одиночные кристаллы — друзы. В центральном цилиндре проводящая ткань расположена пучками. В пучках функционирует камбий (рисунок 10).

Рисунок 10 — Анатомия сердцевинной части стебля (х 180) 1-ксилема, 2 склеренхима, 3 флоэма, 4-экстрактивные вещества в ксилемных сосудах, 5-сердцевинная паренхима.

Сосуды толстостенные расположены группами. Вокруг каждого пучка группа перициклических волокон. Сердцевинная паренхима рассеянная. Сердцевина в поперечном сечении круглая, состоит из крупных тонкостенных клеток. В клетках паренхимы встречаются вместилища с биологическими активными веществами (рисунок 11).

Исследование методом оптической микроскопии проводится с целью установления ботанической принадлежности растения, из которого получен исследуемый объект. При этом используют оптические микроскопы. Cвет при осмотре — искусственный, отраженный. Увеличение — от 18 до 40 крат. В таких условиях обычно четко выявляются анатомические признаки растений.

Рисунок 11 — Внутреннее строение стебля (х 760) 1-содержимое клеток, 2- склеренхима, 3-флоэма.

Таким образом, основными анатомо-морфологическими признаками кермека Гмелина являются следующие:

• 1. Частицы нижней и верхней эпидермы листьев;
• 2. Одноклеточные трихомы, слегка изогнутые с заостренной верхушкой и грубобородавчатой поверхностью;
• 3. Наличие в сердцевинной паренхиме стебля вместилищ с биологическим активными веществами.

Ассимиляционная ткань в стебле сохраняется даже в растениях постгенеративной фазы, а их наличие является устойчивым диагностическим признаком растения кермека Гмелина. Совокупность перечисленных признаков свидетельствует о том, что исследуемое вещество представляет собой смесь надземных частей растений кермека Гмелина, т. е. траву растений кермека Гмелина.

Качественные реакции. Для предварительной оценки компонентов надземной части кермека Гмелина было получено 50%-ное водно-спиртовое извлечение. Флавоноиды определяли по реакции с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида Р. На часовом стекле к 1 мл 50%-ных водно-спиртовых экстрактов приливали 1 мл хлорида алюминия, появляется желтое с зеленоватым оттенком окрашивание, свидетельствующее о наличии в сырье флавонов, флавононов, флавонолов и их производных. От добавления 1 мл 1% водного раствора квасцов железоаммониевых Р или 1% раствора хлорида железа Р появляется черно-синеее или темно-серое окрашивание, свидетельствующее о наличии дубильных веществ с тремя вицинально расположенными фенольными гидроксильными группами [36].

Доброкачественность исследуемого вида растения была изучена по всем показателям, предъявляемым к растительному сырью согласно требованиям ГФ РК, Европейской Фармакопеи, а также другой литературы [11−12].

Числовые показатели. Влажность надземной части Limonium Gmelinii определялась по методу ГФ РК, Т.1, с. 235. Содержание влаги в образцах сырья находили в пределах от 7,15 до 8,10%, поэтому в проект АНД предлагаем показатель влажности не более 10%.

Анализ на золу общую выполняли по ГФ РК, Т.1, с. 129, средние результаты составили от 4,89 до 4,95%, поэтому в проекте АНД общая зола нормирована не более 6%.

Золу, нерастворимую в 10% растворе кислоты хлороводородной Р, определяли по методике ГФ РК, Т.1, с. 226, средние результаты составили от 0,92 до 1,0%, поэтому в проекте АНД предлагаем значение данного показателя не более 1,5%.

Количественное определение дубильных веществ определяли по методике (ГФ РК I, т. 1, 2.9.12), средние результаты составили от 11,70% до 12,05%, поэтому в проекте АНД предлагаем значение не менее 10%.

Данные, полученные при анализировании сырья, сбора сентябрь 2012 г. (таблица 2).

Таблица 2. Показатели доброкачественности исследуемого вида растения

Как видно из данных, представленных в таблице 2, все установленные показатели свидетельствуют о хорошем качестве сырья, так как они соответствуют фармакопейным образцам. Следовательно, исследуемое сырье можно использовать для выделения субстанции [45].

Микробиологическая чистота сырья проведен специалистами РГКП «Научно-практический центр санитарно-эпидемиологической экспертизы и мониторинга». Препарат должен выдерживать требования к микробиологическим показателям лекарственных средств в соответствии с ГФ РК I, т. 1, 5.1.4, категория 4 А. В 1 г препарата допускается наличие не более 10⁷ бактерий и 10⁵ дрожжевых и плесневых грибов (суммарно) и не более 100 Escherichia coli (ГФ РК I, Т. 1, 2.6.12, 2.6.13.).

Радиационный контроль сырья проведен специалистами РГКП «Научно-практический центр санитарно-эпидемиологической экспертизы и мониторинга».

Количественное содержание тяжелых металлов установлен специалистами РГКП «Научно-практический центр санитарно-эпидемиологической экспертизы и мониторинга».

Исследование влияния субстанции, выделенной из травы кермека Гмелина (Limonium gmelinii), на морфофункциональные особенности печени и почек мышей в условиях воздействия четыреххлористого углерода было проведено на кафедре общей гигиены и экологии Казахского Национального медицинского университета им. С. Д. Асфендиярова.

В опытах было использовано 50 мышей-самцов весом 28−30 г. Животные были разделены на контрольные и опытные группы (по 5 животных в каждой): 1 — интактные животные; животные опытных групп (2−8) получали внутрибрижелудочно: 2 — раствор cубстанции (фитопрепарат) в дозе 10 мг/кг; 3 — раствор субстанции в дозе 100 мг/кг; 4 — раствор субстанции в дозе 200 мг/кг; 5 — раствор субстанции в дозе 500 мг/кг; 6 — раствор CCl₄ 50% 1 мл/кг; 7 — CCl₄ 50% 1 мл/кг и субстанцию в дозе 10 мг/кг; 8 — CCl₄ 50% 1мл/кг и субстанцию в дозе 100 мг/кг; 9 — CCl₄ 50% 1мл/кг и субстанцию в дозе 200 мг/кг; 10 — CCl₄ 50% 1мл/кг и субстанцию в дозе 500 мг/кг. Фитопрепарат вводили за 1 час до введения CCl₄ в течение 6 дней. Морфофункциональные исследования проводили по общепринятым методикам.

При проведении эксперимента были сделаны следующие выводы:

• — у мышей, получавших только фитопрепарат, не отмечались изменения функции и структуры исследуемых органов;
• — у мышей, интоксицированных CCl₄ развивались признаки токсического поражения организма. Отмечалось увеличение относительной массы печени и почек, возрастание уровня креатинина, АлТ, СОЭ, лимфоцитов, моноцитов и незрелых клеточных форм в крови. Микроскопическое исследование показало, что в печени отмечаются явления макровезикулярного стеатоза, некробиотических изменений гепатоцитов, пролиферация клеток Купфера; в почках развиваются атрофия канальцев, многоклеточность клубочков, интерстициальный отек;
• — фитопрепарат предупреждал развитие выраженных морфо-функциональных изменений в печени и почках у экспериментальных животных, однако полностью не предотвращал наблюдаемые изменения, что вероятно связано с выраженным гепатои нефотоксическим действием последнего.

Сравнительные исследования антиоксидантной активности надземной части кермека Гмелина и его корней, проведенные в Институте физиологии человека и животных МОН РК, показало их соизмеримость (рисунок 12).

Рисунок 12 — Влияние субстанции из корней и надземной части кермека Гмелина на уровень ПОЛ в микросомах печени крыс.

Кроме того, антиоксидантная активность субстанций, выделенных из травы и корней кермека Гмелина, устанавливалась также в Научно-исследовательском институте химии университета г. Карачи (Пакистан). В качестве стандарта был использован пропилгаллат. Исследованные субстанции проявляют более высокую антиоксидантную активность, чем пропилгаллат, который был использован в качестве стандарта.

Выраженная антиоксидантная активность субстанции, выделенной из травы кермека Гмелина, и ее соизмеримость с таковой для корней кермека Гмелина позволяет ввести ее в медицину и судить о перспективности использования травы для создания не ее основе новых лекарственных средств растительного происхождения.

Введение

травы L. gmelinii в практическую медицину позволит использовать промышленно значимое растение кермек в целом, что очень важно для увеличения их сырьевой базы и ассортимента лекарственных средств [46, 52].