Типы репарации. 
Репарация ДНК

По отношению к процессу репликации различают два типа репарации ДНК:

• 1. Дорепликативную (включающую фотореактивационную и эксцизионную формы, направленные на вырезание поврежденных участков ДНК);
• 2. Пострепликативную (осуществляемую с помощью механизмов, участвующих в процессах рекомбинации и репликации ДНК).

Репарация может осуществляться как конститутивно с помощью специфического набора ферментов, постоянно присутствующих в нормально функционирующих клетках (фотореактивационная, эксцизионная и пострепликативная), так и в ответ на повреждение ДНК или прекращение ее синтеза (путем активации группы генов, контролирующих различные клеточные функции, так называемая SOS-репарация).

У бактерий имеются по крайней мере 2 ферментные системы, ведущие репарацию — прямая и эксцизионная.

Типы репарации ДНК:

* Прямое исправление повреждений Наиболее частая причина точечных мутаций у человека: это спонтанное добавление метильной группы — один из типов алкилирования. Такие модификации исправляются без разрушения цепи ДНК ферментами — гликозилазами. Фермент О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераз (MGMT) защищает клетку от токсических эффектов, производимых алкилирующими агентами, переводя для этого метильную группу из О-6-метилгуанин-ДНК в цистеиновый остаток в MGMT.

* Починка путем вырезания основания (эксцизионной репарации основания — BER).

Главные способы, посредством которых происходит починка оснований ДНК, включают устранение поврежденного основания, которое осуществляют ферменты нуклеазы. Возникающая лакуна может быть заполнена ДНК-полимеразой, что сопровождается лигацией с родительской ДНК. Окислительные повреждения, как основные, так и индуцированные, являются важными причинами для починки оснований ДНК.

* Починка путем вырезания нуклеотида (эксцизионной репарации нуклеотида — NER).

Система NER обеспечивает способность клетки устранять объемные повреждения в ДНК. NER удаляет содержащий повреждение олигонуклеотид из ДНК посредством распознавания повреждения, разреза, вырезания, нового повторного синтеза и лигации. ДНК-полимеразы (у эукариот их известно более 15) различаются по ряду признаков, в том числе по количеству нуклеотидов, которые они могут встроить в растущую цепь за один акт связывания с дуплексом ДНК. присоединяют один нуклеотид, а при участии белка l и bДНК-полимеразы — e иdPCNA (proliferating cell nuclear antigen) ДНК-полимеразы способны вставить фрагмент необходимой длины. Повреждения ДНК в активно транскрибирующих генах, особенно в транскрибирующей спирали, чинятся в первую очередь и потому быстрее, чем повреждения ДНК в остальной части генома. Так клетка защищает целостность процесса транскрипции.

* Репарация ошибок спаривания — мисмэтч репарация (mismatch — MMR).

Этот метод исправляет ошибочно встроенные неповрежденные основания, которые не образуют нормальное Уотсон-Криковское спаривание (A * T, C * G). Такие ошибки иногда происходят при репликации с помощью ДНК — полимеразы. В MMR участвуют ферменты, вовлеченные в BER и NER, а также специализированные ферменты. Синтез ДНК при MMR осуществляется ДНК-полимеразами.

* Гомологичная рекомбинация У эукариот существует два основных способа устранить двухцепочечные разрывы: гомологичная рекомбинация (рекомбинационная репарация) и соединение негомологичных концов. Прямое соединение сломанных концов требует специальных ферментов, которые узнают и связывают разорванные концы с последующим их сшиванием. Починка разрывов двойной спирали (и разрывов одной спирали) обычно включает в себя продуцирование трехконечного односпирального хвоста с помощью экзонуклеаз или геликаз. Посредством инвазии спирали, при которой односпиральный хвост вторгается в неповрежденную гомологичную молекулу ДНК, синтезируется ДНК. Одновременно образуется так называемое холлидеевское сочленение в комплексе ДНК. Через промежуток этого сочленения проводятся две молекулы ДНК (как со структуральным перекрестом, так и без него), каждая из которых более не содержит разрывов.

* Негомологичное соединение концов-NHEJ (Nonhomologous End-Joining).

Если разорванная ДНК имеет тупые концы, и соединение двух фрагментов ДНК происходит случайно, то такая репарация называется NHEJ. Главным компонентом NHEJ восстановительного комплекса является зависящий от ДНК белок киназа (DNA-PK), или белок Ku — гетеродимерная субъединица, состоящая из двух белков Ku70 и Ku80. Этот белок служит для выравнивания концов разорванной ДНК, чтобы упростить процесс их склеивания или выступает в качестве сигнальной молекулы для мобилизации других восстанавливающих белков.

Рассмотрим подробнее некоторые из вышеперечисленных типов.

Прямая репарация ДНК

Прямая репарация ДНК обеспечивает прямое восстановление исходной структуры ДНК или удаление повреждения. Широко распространенная система репарации такого рода — фотореактивация пиримидиновых димеров. Кроме нее, к этому типу относятся: репарация ДНК за счет 3'-5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, репарация одноцепочечных разрывов ДНК с помощью полинуклеотиллигазы, а также генетическая репарация повреждений, вызванных алкильными или метильными группами, путем удаления этих групп специфическими ферментами.

Фотореактивация

В 1949 г. А. Кельнер и в 1950 г. Р. Дульбекко установили, что жизнеспособность актиномицетов и бактерий, подвергнутых УФ-облучению в летальных дозах, восстанавливается, если затем воздействовать на них видимым светом. Явление было названо фотореактивацией. Эффективность ее зависит от уровня рН, температуры и физиологического состояния клетки. Восстановительный эффект при фотореактивации (рис.) связан с действием фермента — дезоксирибозидпиримидинфотолиазы, представляющего собой полипептид, ассоциированный для его активности с небольшой молекулой РНК (10−15 нуклеотидов).

Этот фермент расщепляет димеры двух соседних пиримидинов циклобутанового типа в одной цепи ДНК, образующиеся под влиянием УФ-лучей, действие которых подробнее рассмотрено в нашей статье. Каждый из димеров задерживает репликацию примерно на 10 секунд. Фермент присоединяется к ним и в темноте, и на свету, но реакция расщепления связей, объединяющих две молекулы пиримидинов, энергетически зависит от действия видимого света с большей длиной волны. На свету пиримидиновые димеры расщепляются, за счет разрыва ковалентных связей происходит мономеризация и таким образом восстанавливается нативная структура ДНК. К эффективному диапазону (365−490 нм) относятся наиболее длинноволновые УФ-лучи (365−390 нм) и примыкающие к ним видимые синие лучи (435−495 нм). Наибольшая эффективность фотореактивации отмечена для голубой части видимого спектра. Если же необходимо исключить возможность реактивации, то опыты следует проводить в более длинноволновой части спектра, начиная с желтого света (570−590 нм).

За 1 минуту молекула фотолиазы может расщепить 2,4 димера. У Е. coli система фотореактивации удаляет до 90% пиримидиновых димеров и контролируется одним геном — phr. Штаммы, несущие мутацию по этому гену, не способны к репарации ДНК.

Фотореактивации подвергаются только циклобутановые димеры. Надо отметить, что это пока почти единственная, известная ферментная реакция, в которой фактором активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. Дезоксирибозидпиримидинфотолиаза широко распространена у разных органических форм и представлена даже у таких примитивных микроорганизмов, как микоплазмы. Она есть у всех изученных бактерий, кроме Micrococcus radiodurans, которые чрезвычайно устойчивы к действию УФ-лучей и выдерживают дозы в 1 000 раз более высокие, чем те, что детальны для E.coli. Фотолиаза обнаружена в клетках многих растений и животных, в том числе и у человека. По-видимому, наибольшее значение фотореактивация имеет у растений.

Эксцизионная репарация

Существуют системы генетической репарации, работа которых напоминает «хирургическое» вмешательство в структуру ДНК: поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК, отсюда происходит и термин «эксцизиониая репарация» (англ. excision — вырезание). Сам феномен известен еще с 1955 г., однако, молекулярный механизм эксцизионной репарации был раскрыт гораздо позже — в 1964 г., в результате работ нескольких групп исследователей налиниях мутантных бактерий, чувствительных к действию радиации. Оказалось, что данный тип генетической репарации обеспечивает вырезание неверного или поврежденного нуклеотида / участка ДНК, последующую синтез застройку бреши и лигирование. К этому типу относится несколько специализированных механизмов, например, гликозилазы удаляют лишь модифицированные основания, АР-эндонуклеазы — апуриновые сайты, и т. п. По-видимому, именно системы эксцизионной репарации восстанавливают большую часть повреждений ДНК в клетке.

Общая схема эксцизионной репарации, действующей по принципу «режь-латай», включает несколько этапов:

1. Узнавание повреждения УФ-эндонуклеазой (у E. coli этот фермент называют UvrABC-эндонуклеазой);

В случае пиримидиновых димеров или моноаддуктов повреждение распознается легко. В других случаях, например, при неправильном спаривании нуклеотидов, оба нуклеотида (правильный и неверный) эквивалентны для многих видов эксцизионной репарации, однако существуют специализированные системы, позволяющие в большинстве случаев восстанавливать нативную структуру.

• 2. Инцизия (надрезание) цепи ДНК этим ферментом по обе стороны от повреждения;
• 3. Эксцизия (вырезание и удаление) фрагмента ДНК, содержащего повреждение, происходит при участии геликазы — фермента, расплетающего молекулу ДНК для высвобождения концов после первичных надрезов;
• 4. Ресинтез, в ходе которого ДНК-полимераза I застраивает образовавшуюся брешь благодаря своей 5'-3'-полимеразной активности, а ДНК-лигаза ковалентно присоединяет 3'-конец вновь синтезированного материала к ранее синтезированной ДНК.

Эксцизионная репарация ДНК завершается при возникновении ковалентных связей репарированного участка со скелетом полинуклеотида. Таким образом, обеспечивается непрерывность в ранее поврежденной цепи двухцепочечной молекулы ДНК. В целом, эксцизионная репарация обычно распознает нарушения вторичной структуры ДНК (двойной спирали) и вырезает их.

У Е. coli выделяют три вида эксцизионной репарации, различающихся по длине вырезаемых фрагментов поврежденной ДНК (короткие, длинные и очень короткие).

Эксцизионная репарация коротких фрагментов является конститутивной и контролируются системой uvr-генов (А, В, С, D). Размер вырезаемого фрагмента цепи ДНК составляет около 20 оснований. Комплекс UvrAB распознает повреждение (пиримидиновый димер, моноаддукт), затем UvrA отсоединяется, a UvrC присоединяется, новый комплекс осуществляет разрез на 7 нуклеотидов в 5'-сторопу от повреждения и 3−4 нуклеотида в другую. UvrD продуцирует геликазу, которая раскручивает ДНК для высвобождения концов цепей. Этап эксцизии обычно осуществляется ДНК-полимеразой I, которая помимо полимеразной имеет и экзонуклеазную активность. Этот фермент, как правило, застраивает короткие участки (до 30 нуклеотидов). ДНК-полимераза II способна вырезать и застраивать более длинные бреши (до 1 000−1 500 нуклеотидов). Такие же функции присущи экзонуклеазе VII. Таким образом, отдельные этапы могут выполняться различными ферментами, что повышает надежность системы. Данный тип репарации ДНК удаляет примерно 99% моноаддуктов.

Эксцизионная репарация длинных повреждений контролируется той же системой генов, однако, является индуцибельной. Размеры вырезаемых фрагментов в отдельных случаях могут превышать и 9 000 нуклеотидов.

К специализированным системам эксцизионной репарации ДНК можно отнести эксцизионную репарацию очень коротких фрагментов. Она специфически удаляет Т в парах GT и СТ, используя продукты генов mutL и mutS. Другая система подобного рода, основанная на работе гена mutY, кодирующего аденингликозилазу, вырезает, А в парах AG и АС. Эти системы могут работать очень успешно вскоре после синтеза ДНК.

Мисмэтч-репарация Мисмэтч-репарация исправляет ошибки, возникающие в результате нарушения комплементарности пар AT или GC в дочерней цепи при включении в них некомплементарных нуклеотидов. Особенность данного механизма, состоит в том, что он способен отличить «старую» цепь ДНК от «новой» и исправить именно вновь синтезированную. В основе данного феномена лежит то важное свойство, что материнская цепь несет в последовательностях GATC аденины с присоединенными к ним сразу после окончания репликации метальными группами.

Вследствие этого во время следующего цикла репликации материнская и дочерняя цепи становятся структурно различимыми, так как до окончания данного цикла дочерняя цепь остается неметилированной. Именно в этот временной промежуток и должны быть исправлены ошибки спаривания оснований. Генетическая репарация неспаренных оснований обнаружена в клетках и человека, и дрожжей. Механизм коррекции ошибок такого типа, базирующийся на сочетанном действии продуктов четырех генов mut (И, L, S и U) и получивший название «система MutHSLU», достаточно хорошо изучен у E. coli. Такое взаимодействие протекает в несколько этапов, на первом из которых к паре некомплементарных оснований присоединяется MutS — белковый продукт гена mutS, распознающего нарушения такого типа. Соединившись с участком, включающим неправильное основание, этот белок сразу же образует комплекс и с продуктом гена mutt. Сформированный трехчленный комплекс активирует продукт гена тutН (до этого момента находившийся в латентном состоянии) для связывания с ближайшей неметилированной последовательностью GATC. Обладающий эндонуклеазной активностью продукт гена тutН может разрезать дочернюю цепь как с 5'-, так и с З'-стороны от аденина. В первом случае к белку MutH присоединится экзонуклеаза, которая разрушит дочернюю цепь в направлении 5'-3' до места неверного спаривания и несколько дальше. А во втором — другая экзонуклеаза, c 3'-5'-активностью, двигаясь по дочерней цепи ДНК, также разрушит ее ошибочный фрагмент. Дальнейший ход событий аналогичен описанным этапам ресинтеза и лигирования концов в ходе эксцизионной репарации. Механизм коррекции, при котором восстановлению подвергается определенная цепь ДНК, называется направленным. Эксцизионная репарация обнаружена как у простейших, так и в культуре клеток млекопитающих. В частности в культуре клеток здоровых людей после облучения ее ультрафиолетом через 20 ч из ДНК исчезает до 90% тиминовых димеров (со скоростью около 40 000 димеров в час).

Пострепликативная репарация осуществляется в тех случаях, когда повреждение доживает до фазы репликации (слишком много повреждений, или повреждение возникло непосредственно перед репликацией) или имеет такую природу, которая делает невозможным его исправление с помощью эксцизионной репарации (например, сшивка цепей ДНК). Важная характеристика пострепликативной системы репарации — точность синтеза ДНК, не уступающая той, что наблюдается при обычной репликации.

Эта система играет особенно важную роль у эукариот, обеспечивая возможность копирования даже с поврежденной матрицы (хотя и с увеличенным количеством ошибок). Одна из разновидностей этого типа репарации ДНК-рекомбинационная репарация.

Данный вариант пострепликативной репарации использует рекомбинацию для получения неповрежденной копии генетического материала. Этот тип репарации ДНК был открыт в клетках мутантов E. coli, неспособных выщеплять тиминовые димеры.

После действия ультрафиолета в таких клетках с помощью ДНК-полимеразы III синтезируется ДНК с одноцепочечными пробелами-брешами, которые исчезают при последующей инкубации клеток в питательной среде за счет рекомбинации между двумя сестринскими дуплексами. У Е. coli эти обмены осуществляются с помощью продуктов генов rec (А, В и С). Кроме них, в заключительном этапе ресинтеза и сшивания участвуют ДНК-полимераза I илигаза.

Механизм пострепликативной репарации ДНК, происходящей уже в первые минуты после облучения, наименее специфичен, гак как отсутствует этап узнавания повреждения. Это быстрый способ восстановления нативной структуры, по крайней мере, части дочерних молекул ДНК. Таким образом, данная система позволяет полностью пройти процессу репликации на матрице поврежденной ДНК, но не удаляет повреждения: оно остается в исходных родительских цепях и может быть удалено на других этапах клеточного цикла, например, с помощью эксцизионной репарации.

SOS-репарация

Существуют системы генетической репарации, при которых точность синтеза невысока. Они являются индуцибельными, и, очевидно, обусловлены необходимостью синтеза ДНК даже на матрице, содержащей повреждения. При этом синтез ДНК на матрице, оставшейся неповрежденной, будет сопровождаться большим количеством ошибок. Индукцию процессов репарации, сопровождающуюся увеличением числа ошибок последней, обнаружил в 1953 г. Дж. Уэйгл (при заражении УФ-облученных клеток Е. coli облученным же фагом X).

В честь первооткрывателя этот тип генетической репарации в 1974 г. М. Радман назвал W-реактивацией (Weigle-reactivalion). W-реактивация дает возможность многим димерам пиримидина, возникающим в бактериальной клетке, дожить до периода синтеза ДНК. Хотя такая ДНК и содержит значительное количество ошибок, поврежденные клетки действительно «спасаются» на каком-то этапе, если только жизненно важные функции не оказались безнадежно нарушенными. Тогда же было показано, что реализация этого механизма возможна только при наличии продуктов генов гесА и lexA.

М. Радман в 1974 г. и Э. Виткин в 1975 г. сформулировали представления об индуцибельной системе генетической репарации, включающейся при появлении затруднений в синтезе ДНК, возникших вследствие сохранившихся димеров, число которых должго быть не менее 30−60. В связи со спасательными функциями этой системы репарации ДНК она была названа SOS-репарацией.

Таким образом, важная особенность прокариотических и эукариотических клеток состоит в их способности увеличивать эффективность генетической репарации при высокой дозе повреждений. Это возможно в результате индукции новой или модификации одной из пресушествующих ДНК-полимераз за счет белковых продуктов генов, активируемых повреждающими агентами. Например, появление таких ферментов в случае УФ-облучения обеспечивает транедимерный синтез ДНК, в результате которого напротив тиминового димера будет находиться не брешь, а какой-либо нуклеотид. Разумеется, такая произвольная подстановка нуклеотида во вновь образующуюся цепь ДНК часто приводит к ошибкам репликации.

В клетках Е. coli сигналом для индукции SOS-репарации служит замедление синтеза ДНК. Ответом на этот сигнал является ингибирование клеточного деления, индукция эксцизионной репарации с длинными вырезаемыми фрагментами и затем — рекомбинационной репарации.

По-видимому, непосредственным стимулом к запуску механизмов SOS-репарации служит накопление одноцепочечных разрывов ДНК, индуцирующее протеазную активность белка RecA который специфически взаимодействует с белком LexA — репрессором для генов rec (В, С, Е, F, J) и uvrB. Разрезание белка LexA приводит к снятию репрессии и запуску синтеза белковых продуктов указанных выше генов. Кроме того, разрезание белка LexA приводит к кратковременному увеличению его синтеза в клетке, поскольку данный белок является репрессором собственного гена (аутогенный контроль). Далее в результате работы репарационных систем происходит уменьшение количества одноцепочечных разрывов в ДНК, тем самым снижается индуцирующий SOS-репарацию сигнал, белок RecA теряет протеазную активность, и механизмы SOS-репарации выключаются.

Интересные факты

• * Полагают, что от 80% до 90% всех раковых заболеваний связаны с отсутствием репарации ДНК.
• * Повреждение ДНК под воздействием факторов окружающей среды, а также нормальных метаболических процессов, происходящих в клетке, происходит с частотой от нескольких сотен до 1000 случаев в каждой клетке, каждый час.