Выбор фермента рестрикции

Обсуждаемые молекулярные основы вариабельности членов семейств ГВР заключаются в разном количестве повторяющихся единиц в каждом ГВР-локусе. Чтобы выявить вариации подобного рода с возможно большим разрешением, необходимо гидролизовать ДНК ферментом рестрикции, который расщепляет достаточно часто, но не нарушает целостности повторяющихся единиц ГВР. Для обсуждаемых ГВР удобно использовать рестриктазы HinW, Mbol, AluA и Haelll.

В некоторых случаях встречаются фрагменты с такими близкими значениями Ш, что их нельзя разрешить на картине фореза. Тогда полезно повторить эксперимент с использованием другого фермента. При этом имеет место «перетасовка» рестриктов ГВР, что дает нам лишний шанс разделить сомнительные полосы. Когда используется фермент рестрикции, узнающий четырехнуклеотидную последовательность, эффект «перетасовки» обычно едва заметен, особенно для высокомолекулярных фрагментов, так как вклад в величину этих фрагментов фланкирующих последовательностей невелик, независимо от того, какой фермент используется. Тем не менее, некоторые полосы можно идентифицировать благодаря тому, что их подвижность по другим ферментам будет лишь немного изменена. Для достижения эффекта «перетасовки» наиболее подходящим считают фермент рестрикции Haelll.

Для каждой рестриктазы существуют оптимальные условия реакции (температура, состав буфера), которые приводятся в описании, прилагаемом фирмой-изготовителем. Например, фирма Ферментас предлагает для работы со своими рестриктазами пять буферных растворов — B (голубой), G (зеленый), O (оранжевый), R (красный) и Y (желтый).

Если необходимо подобрать условия гидролиза ДНК обеими рестриктазами одновременно, это можно сделать на основании данных об активности каждой из рестриктаз во всех пяти буферных системах (взятых из каталога фирмы, см. таблицу) или воспользоваться программой DoubleDigest™, которую можно найти на сайте www.fermentas.com. Эта программа рекомендует 2хY (Tango) буфер (двухкратный желтый буфер) для одновременного гидролиза NcoI и BglII. В нем обе рестриктазы имеют 100% активность.

Единица активности рестриктазы — это количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК в реакционной смеси 50 мкл при оптимальных условиях (обычно при 37 ^оС) за час. Рестриктазы хранятся при -20 ^оС в буфере с 50% глицерина. Ферменты, вынутые из морозильной камеры, следует держать только во льду и не дольше, чем это необходимо. Объем добавляемых рестриктаз не должен превышать 1/10 от объема реакционной смеси, иначе избыток глицерина ингибирует реакцию.