Влияние условий инкубации на процесс дегрануляции тучных клеток

Ильин Д.А.

Актуальность изучения роли клеток соединительной ткани в воспалительных процессах определяется трудностями коррекции хронических воспалительных заболеваний и неоднозначным прогнозом в отношении восстановления трудоспособности пациентов [3; 4].

Во многих областях биологии и медицины находят свое применение клеточные культуры, поскольку они представляют собой удобный инструмент для решения многих проблем, имеющих важное практическое значение [1; 2].

Известно, что при совместном культивировании тучных клеток и фагоцитов наблюдается значительная активизация фагоцитарной функции макрофагов [6], а от концентрации клеток зависит выраженность иммунного ответа [2]. После воздействия липополисахарида в качестве разрешающего стимула иммунокомпетентные клетки переходят в состояние повышенной активности [5], которая реализуется посредством секреции различного рода факторов, являющихся регуляторами последующих клеточных реакций [2]. Поскольку многие функции лаброцитов изучены недостаточно [2; 7; 8], то уточнение особенностей их дегрануляции необходимо признать целесообразным. лаброцит дегрануляция тучная клетка Целью работы являлось изучение: состояния лаброцитов в культурах перитонеальных клеток, выделенных из брюшной полости мышей линий C57BL/6 и CBA, в зависимости от концентрации посадки; характера взаимодействия клеток при совместном инкубировании культур фибробластов и перитонеальных клеток, при различной концентрации посадки последних; влияние липополисахарида на активность процесса дегрануляции лаброцитов.

В зависимости от генетической принадлежности и концентрации посадки клеток были сформированы следующие группы культур. Концентрация посадки в контрольных группах составляла 1000 тыс. перитонеальных клеток в 1 мл взвеси, выделенных от мышей линий C57BL/6 и CBA, а в экспериментальных группах она соответствовала 500 тыс. клеток в 1 мл.

При проведении эксперимента по совместной инкубации культур перитонеальных клеток (содержащих лаброциты) и фибробластов, полученных от мышей линии C3H, в первой группе одномоментно вносили взвесь в объеме 1,5 мл, содержащую 100 тыс. фибробластов и 1000 тыс. перитонеальных клеток, выделенных из брюшной полости мышей линии C3H. Аналогичным образом формировали культуры второй группы, с той разницей, что концентрация посадки составляла 500 тыс. перитонеальных клеток.

Липополисахарид (пирогенал) вносили в культуры перитонеальных клеток мышей линии СВА после предварительного инкубирования в течение 24 часов, из расчета 2,5 мкг на флакон. Результаты сравнивали с интактными культурами клеток от мышей данной линии.

Клетки инкубировали при температуре 37 С. Препараты фиксировали 50% раствором этанола и окрашивали азур — эозином. Подсчет лаброцитов проводили дифференцированно для дегранулирующих и не дегранулирующих клеток. Результаты оценивали на 2, 24, 48 и 72 часа инкубации. Контролем служили культуры, инкубируемые в течение 2 часов. Все последующие изменения описаны относительно контроля.

В культурах перитонеальных клеток с высокой концентрацией посадки лаброциты присутствовали в препаратах уже на ранние сроки инкубации, чего не наблюдали в группах с пониженной концентрацией клеток.

Это явление можно объяснить тем, что при низкой концентрации посадки перитонеальных клеток, последние не успевают в достаточной мере продуцировать матрикс, который способствует прикреплению лаброцитов. В процессе промывки смываются слабо прикрепленные тяжелые тучные клетки, контактирующие с подложкой незначительной частью площади мембраны. Поскольку наличие белкового матрикса во многом обеспечивает адекватное прикрепление, то вполне объяснимо и большее содержание лаброцитов на поздних сроках инкубации в препаратах культур с высокой концентрацией клеток.

В таких культурах активность накопления метаболитов и секреция медиаторов макрофагами была повышенной, что и способствовало процессу дегрануляции. При пониженном содержании клеток требовалось значительно больше времени для накопления указанных веществ. В культурах, полученных от животных линии СВА, находили большее количество лаброцитов, чем в культурах групп C57BL/6 с аналогичными условиями культивирования.

В культурах группы с высокой концентрацией перитонеальных клеток при одномоментной посадки с фибробластами были созданы наиболее благоприятные условия для инкубации клеток соединительной ткани и фагоцитов. По этой причине в данной группе культур на 48 часов наблюдения лаброциты дегранулировали реже, чем в группе с низкой концентрацией клеток в 1,6 раза.

Инкубация перитонеальных клеток с липополисахаридом способствовала дегрануляции лаброцитов. Отмечали, что на 48 часов экспозиции показатель дегрануляции был в 1,9 раза выше, чем в контрольных культурах.

Таким образом, показана зависимость концентрации лаброцитов и степени активности дегрануляции от плотности посадки клеток, генетической принадлежности культур и сроков их инкубации.

Полученные данные могут использоваться при моделировании процессов хронического воспаления с различной концентрацией лаброцитов и активностью процесса дегрануляции, что является одним из этапов разработки методов коррекции хронических воспалительных заболеваний.

Метод совместной инкубации перитонеальных клеток и фибробластов может быть использован при разработке моделей формирования очагов хронического воспаления при гранулематозных заболеваниях, и для изучения особенностей протекания процесса фиброзирования гранулем.

Поскольку инкубация клеток с липополисахаридом способствовала дегрануляции лаброцитов, то данный метод целесообразно применять для моделирования процесса дегрануляции лаброцитов in vitro, а культуральная среда, обогащенная биологически активными веществами, может быть использована для изучения влияния растворимых факторов на регуляцию последующих клеточных реакций.