Генная терапия: наследственные болезни

Многие болезни крови связаны с унаследованными мутациями. Так, замена одного нуклеотида ведет к появлению гемоглобина S и развитию серповидноклеточной анемии. Точечные мутации лежат также в основе наследственных иммунодефицитов, например тяжелого комбинированного иммунодефицита вследствие недостаточности аденозиндезаминазы.

Введение

в стволовые клетки крови генов, восстанавливающих нормальную функцию клеток, должно оказывать лечебное действие — например, введение гена аденозиндезаминазы может обеспечить нормальное развитие Ти В-лимфоцитов. Широкому применению этого метода сегодня мешает несколько сложностей, одна из которых — слабая и непродолжительная экспрессия введенных генов в клетках крови.

То, что мы рассказывали во введении про девочку, представляет собой пример лечения одной из наследственных болезней метаболизма — недостаточности аденозиндезаминазы. Примеры наследственных болезней метаболизма многочисленны. О некоторых вы наверняка много раз слышали: фенилкетонурия, галактозэмия, семейная гиперхолестеролэмия, уже упоминавшийся синдром Леша-Нихана. Они связаны с дефицитом того или другого фермента, возникающим вследствие повреждения соответствующего гена. Как правило, эти болезни встречаются не часто, но следствия их крайне неприятны. Они в большинстве своем рецессивны.

Пример с аденозиндезаминазой показывает, как недостаток всего одного фермента приводит к острой иммунной недостаточности вследствие того, что в процессе метаболизма пуринов накапливаются токсичные промежуточные продукты, аденозин и 2'-дезоксиаденозин, которые селективно уничтожают Т-клетки. Генно-терапевтическая стратегия в этих случаях облегчается тем, что обычно для нормального существования организма не обязателен 100% нормальный уровень фермента, отсутствующего у больного. Уровень фермента 5- 25% от нормы часто вполне достаточен для совершенно здорового существования.

Например, гемофилия В, происходящая от резкой недостаточности сериновой протеазы, фактора свертывания крови IX, протекает в очень острой форме, если больные имеют менее 1% этого фермента от нормы. Но те, которые имеют от 1 до 10%, чувствуют себя вполне удовлетворительно. Поэтому можно достаточно просто осуществить пополняющую генную терапию. Особенно учитывая рецессивность большинства дефектов метаболизма.

Генотерапия фетальная.

Большинство методов фетальной генотерапии разработаны на трансгенных мышах. Чужеродную ДНК вводят в оплодотворенные яйцеклетки, полученные от мышей, у которых была искусственно стимулирована овуляция. Затем яйцеклетки имплантируют в матку приемной матери. С помощью этого метода удалось заметно улучшить состояние мышей с наследственным дефицитом СТГ, наследственным дефицитом основного белка миелина и наследственным дефицитом бета-цепи глобина. В подобных экспериментах получена важная информация о регуляции экспрессии генов и патогенезе наследственных болезней.

Однако трансгенные животные получаются только из 15−20% яйцеклеток с инъецированной ДНК, причем лишь у 20−30% животных введенный ген экспрессируется. Более того, из-за случайного встраивания чужеродной ДНК в геном есть опасность повреждения гена хозяина (инсерционный мутагенез), приводящего к дефициту белка или нарушению регуляции, что может стать причиной злокачественного новообразования.

Таким образом, фетальная генотерапия пока неприменима для лечения наследственных болезней человека. Однако методы, разработанные в экспериментах с эмбриональными клетками, можно использовать для пренатальной диагностики. Это дает очень много — разумеется, лучше выявить наследственное заболевание на ранней стадии внутриутробного развития, чем прибегать к такому рискованному и ненадежному пока методу, как введение чужеродной ДНК.

Генотерапия соматическая.

Если фетальная генотерапия пока неприменима для лечения наследственных болезней человека, то соматическая генотерапия наследственных болезней проходит клинические испытания.

Есть разные методы введения чужеродной ДНК в клетки-мишени, и выбор метода частично зависит от заболевания. Доставку генетического материала производят с помощью вирусных векторов (ретровирусы, не способные к самостоятельной репликации; аденовирусы; аденоассоциированные вирусы; герпесвирусы и др.) или невирусных систем (липосомы, конъюгаты ДНК-белок и ДНК-белок-дефектный вирус). Существуют два подхода: ex vivo — сначала генетический материал вводят в клетки, выращиваемые в культуре, а затем трансгенные клетки вводят реципиенту, и in vivo — вектор, несущий нужный ген, вводят непосредственно в организм реципиента (рис. 67.2).

Первый подход особенно эффективен, если для доставки используют стволовые кроветворные клетки и другие клетки, которые удается вырастить в культуре в больших количествах; второй же устраняет проблему введения значительного числа клеток в орган-мишень.

В любом случае важно учитывать количественные стороны — какой уровень экспрессии необходим для улучшения состояния больного и достаточны ли уровень экспрессии в трансгенных клетках и их число.

При испытаниях соматической генотерапии чаще всего используют вирусные векторы. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки.

Использование ретровирусных векторов, не способных к самостоятельной репликации, обеспечивает эффективное встраивание чужеродной ДНК в геном и постоянство генетических изменений. Однако эти векторы встраиваются только в делящиеся клетки, могут вызывать инсерционные мутации, дают сравнительно низкие титры рекомбинантного вируса, а экспрессия встроенного гена часто уменьшается до очень низкого уровня через несколько месяцев.

Аденовирусные векторы эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов. Однако используемые в настоящее время аденовирусные векторы вызывают неспецифическое воспаление и антивирусную реакцию клеточного иммунитета, что сокращает длительность экспрессии до недель или месяцев.

Таким образом, используемые сейчас вирусные векторы имеют существенные недостатки. Чтобы соматическая генотерапия стала эффективной, нужно значительно усовершенствовать вирусные векторы, как и другие системы доставки генов.

Число заболеваний, при которых можно использовать соматическую генотерапию, растет. Опыт, накопленный при использовании обычных методов лечения, следует учитывать и при разработке методов генотерапии. Важно учитывать патогенез заболевания, начинать лечение до развития необратимых повреждений, обеспечивать правильное и регулируемое взаимодействие нового белка (продукта вводимого гена) с другими элементами пораженной системы гомеостаза.

Клинические испытания методов соматической генотерапии проводят не только при моногенных заболеваниях, но и при злокачественных новообразованиях, ВИЧ-инфекции и других заболеваниях.

Разрабатываемые методы лечения злокачественных новообразований включают:

• — изменение опухолевых или здоровых клеток больного, с тем чтобы посредством стимуляции синтеза цитокинов или других молекул изменить реакцию организма на злокачественное новообразование;
• — экспрессию антигенов (например, аллогенных антигенов HLA) на опухолевых клетках с целью вызвать на них иммунный ответ;
• — введение генов-супрессоров опухолевого роста или других генов, замедляющих пролиферацию клеток;
• — введение в здоровые клетки (например, клетки костного мозга) генов, обеспечивающих устойчивость к противоопухолевым средствам, для проведения более активной химиотерапии.

Ближайшие перспективы соматической генотерапии пока не ясны. Это многообещающий метод, но для того, чтобы он стал по-настоящему эффективным, нужна еще большая работа.