Функции теломеразного комплекса и механизмы его регуляции

Они подробно изложили действие фермента теломеразы, основная функция которого достраивать новые нуклеотидные последовательности в теломерных участках хромосом. Теломераза представляет собой рибонуклеопротеидный комплекс. Для проявления ее активности нужны РНК и белковые компоненты. В качестве каталитической белковой субединицы содержит обратную транскриптазу и матрицу РНК для синтеза комплектарных цепей теломерной ДНК. Этот тип белковой структуры нужен как для репликации ретровирусов, так и для репликации хромосомных теломер эукариот.

Механизм удлинения теломер, называемый элонгацией, происходит путем связывания G-богатой цепи теломер с матричным участком теломеразной РНК, после чего осуществляется РНК-зависимый синтез теломерной ДНК, затем идет транслокация, перемещение ДНК, удлиненной за один повтор относительно фермента. Далее комплементарная цепь достраивается с помощью ДНК-полимеразы.

Теломеразный цикл работы состоит из двух стадий: элонгации и транслокации. Чередуя их, фермент присоединяет к старой цепи десятки или сотни теломерных повторов. Теломерная РНК является не только матрицей, но и важнейшей частью каталитической машины. Если заменить в ней несколько нуклеотидов, то происходит не синтез дефектных повторов, а потеря теломеразной активности.

Теломеразная активность культуры раковых клеток намного выше, чем у нормальных. Экспрессия теломераз также обнаружена в клетках плода, стволовых клетках костного мозга, селезенки и эпидермиса кожи. Эти клетки имеют особенность быстрого обновления. В определенный момент происходит выключение гена, кодирующего теломеразу, практически у всех соматических клеток. Вследствие этого геном оказывается подвержен уменьшению в процессе концевой недорепликации. Теломера укорачивается, ухудшается функционирование хромосом. Когда заканчивается запас теломерных последовательностей происходит деградация смысловых участков ДНК. Экспериментальные исследования выявили, что делетирование гена белка теломеразы ведет к прекращению ее активности. Этот белок формирует активный центр фермента. Существует несколько белков, которые проявляют теломеразную активность. Одни из них соединяются с теломеразным субстратом, регулируют присоединение теломеразы, участвуют в синтезе отстающей цепи, после действия теломеразы. Белковая субъединица теломерная обратная транскриптаза универсальна для эукариот.

Теломеразные РНК исследованы гораздо лучше, чем теломеразные белки. У человека синтез теломеразных РНК происходит с помощью РНК полимеразы нуклеотидных остатков. Ген представлен одной копией на клетку. Первичная структура теломеразных РНК у человека составляет 450, а их длина возрастает от низших организмов к высшим. Разные организмы имеют свою по структуре РНК. Ее последовательность отличается не только у эволюционно далеких организмов, но и у родственных. Нуклеотидные последовательности теломеразных РНК неоднаковы уже в пределах рода. Если нуклеотидные последовательности генов рибосомальных РНК у эволюционно далеких организмов совпадают между собой на 90%, теломеразный комплекс состоит из якорного участка, образованного белком р123 и теломеразной РНК. У дрожжей присутствуют гомологичные белки.

EST1 и EST2. Деление генов этих белков приводит к уменьшению длины теломер. У людей обнаружен теломерный белок ТР1, который взаимодействует с теломеразной РНК. Она в свою очередь распределяет последовательность хромосомных теломер. Научно доказано, что теломерный ген белка р123 при воздействии на него ионизирующей радиации изменяется. В результате этого аминкислотные замены остатков аспарагиновой кислоты приводят к дефектам. Клетки, которые имеют мутантные белки очень быстро стареют за счет резкого укорочения теломер.

Концевые участки, удлиняющиеся теломеразой, содержат ненуклеосомную организацию, в отличие от других частей ДНК, в которых присутствует нуклеосомная организация. У млекопитающих эту организацию имеет лишь небольшое количеств теломерных последовательностей, расположенных в направлении к центромере. В клетках млекопитающих находится теломерсвязывающий белок TRF1, который предположительно осуществляет негативный контроль длины теломер. Этот белок создает плотную упаковку теломер, благодаря чему они относятся к фракции гетерохроматина. Такая система стабилизирует теломеры и делает недоступным для взаимодействия с теломеразой. Наступающая мутация в гене теломеразной РНК, синтезирующей повторяющиеся последовательности, происходит изменение дистальных теломерных повторов и это не позволяет белку TRF1 присоединиться на этих повторах, вследствие чего теломераза становится способной к их удлинению. В S-фазе белок TRF1 диссоциирует от теломеры и вследствие этого начинается ее удлинение. Стабилизирующие белки создают малодоступность теломерной ДНК воздействию ДНК-метилаз и эндонуклеаз, обеспечивая низкую частоту появления двухцепочных разрывов в мейозе.

Исследования в этой области показывают, что увеличение продукции TRF1 приводит к интенсивному укорочению теломер в клетках человека, в то время как уменьшение продукции ведет их к удлинению. Таким образом TRF1 является супрессором элонгации теломер и отрицательным регулятором их длины, так как не наблюдалось его влияния на уровень активности теломеразы. Поэтому исследователи предположили, что он ингибирует действие теломеразы на концах отдельных теломер.

Согласно другому предположению белок TRF1 непосредственно управляет доступом теломеразы к теломерам, регулируя негативную работу данного фермента. Считается, что этот белок связывается с теломерной ДНК, чем индуцирует конформационные изменения, ведущие к ингибированию полимеразной активности. В ходе экспериментов с добавлением мутантных теломерных повторов на теломерный конец, теломерный комплекс доступен действию теломеразы. Теломерный комплек с данным белком может быть как в доступности так и недосягаем.

В соответствие с третьим предположением, белок TRF1 может регулировать теломеразную активность с помощью взаимодействия с белком PinX1, способным соединять каталитическую субъединицу теломеразы и ингибировать ее активность. У дрожжей аналогом главного теломерного белка, регулирующим длину теломер является Rap1. Механизм его действия заключается в образовании структуры, подобной t-петле млекопитающих. Белок Rap1 содействует изгибу двухцепочной теломерной ДНК, что помогает в образовании t-петли. ДНК образует t-петлю, а одноцепочечный выступ внедряется в двухцепочечный участок ДНК, расположенный дистально (рис.). Белковый комплекс позволяет клеткам отличать теломеры от мест разрыва хромосом (ДНК). Не все белки теломер входят в состав комплекса, который избыточен на теломерах, но отсутствует в других районах хромосом. Защитные свойства комплекса вытекают из его способности воздействовать на структуру теломерной ДНК по крайней мере тремя способами: определять структуру самого кончика теломеры; участвовать в образовании t-петли; контролировать синтез теломерной ДНК теломеразой. Родственные комплексы найдены и на теломерах некоторых других видов эукариот.

Рисунок 10. Модель образования t-петлевой структуры на конце хромосомы.

Вверху — теломера в момент репликации хромосомы, когда ее конец доступен для комплекса теломеразы, который осуществляет репликацию (удвоение цепи ДНК на самом кончике хромосомы). После репликации теломерная ДНК (черные линии) вместе с находящимися на ней белками (показаны разноцветными овалами) образует t-петлю (нижняя часть рисунка).

Кроме этого белок выполняет функции транскрипционного активатора и репрессора одновременно. А длина теломер контролируется противоположным действием двух клеточных комплексов. Оба этих комплекса взаимодействуют с теломерной ДНК и контролируются ею. Мутации приводят к блокировке деления ядра. Синтез правильной теломерной последовательности зависит от структуры теломеразной РНК. В противораковой терапии возможно применение индукции изменений теломеразной РНК, которые вызывают появление аномальных теломер, что ведет к остановке клеточного деления.

Иммортализацию культуры клеток можно вызвать путем воздействия облучения. При воздействии радиации наблюдается переход от регулируемого к нерегулируемому состоянию теломер. Если теломера доступна действию теломеразы, то этот процесс будет нелегко обратить назад. Это ведет к потере контроля над длиной возрастающего числа теломер. Белок TRF1, соединившись с дуплексом теломерной ДНК, индуцирует на ней формирование более упорядоченного хроматина. Этот комплекс выполняет важную биологическую функцию по кэпированию концов хромосом.

Высокая теломеразная активность присутствует во всех тканях млекопитающих, подверженных раковой трансформации. In vitro теломеразу могут ингибировать модифицированные олигонуклеотиды, комплектарные матричной области теломеразной РНК, обладающие устойчивостью действию протеаз и нуклеаз. Поддержание определенной длины теломер зависит от взаимодействия с ними теломеразы, теломерных белков и других факторов, управляющих синтезом компонентов теломерного комплекса. Поскольку теломеразная активность присутствует во всех раковых опухолях, то изучение структуры, функции, механизма работы и регуляции активности теломераз представляет важную задачу современной биологии. Но активная теломераза содержится не во всех опухолях и клетках. Выяснилось, что у некоторых из них длина теломер поддерживается за счет рекомбинационного механизма образования теломерной ДНК. Проводятся исследовательские работы по внедрению методов избирательного подавления теломеразной активности в раковых клетках на основании ингибиторов обратных транскриптаз. Одна из ДНК полимераз и искомый ингибитор должен быть направлен на подавление теломеразной ДНК-синтезирующей активности, иначе он будет токсичен для нормальных клеток — в этом и заключается трудность. Недавние работы по описанию избирательного подавления теломеразной РНК, вызывающие гибель раковых клеток в культуре кажутся наиболее обнадеживающими.

С помощью методов молекулярного анализа можно определить наличие теломеразы в биологических культурах. Один из них прямой метод. Заключается он в следующем: в инкубационную смесь с исследуемым материалом вносят меченые дНТФ и добавляют олигонуклеотид, с содержащимися теломерными повторами. Праймер выступает в роли G-цепи, с которой связывается теломераза. О наличии теломеразной активности в материале судят по включению радиоактивной метки в состав олигонуклеотида. Другой метод заключается в использовании полимеразной цепной реакции. В смесь с образцом добавляют G-праймер, С-праймер, ДНКполимеразу и меченые нуклеотиды. Многократно чередующиеся циклы включают взаимодействие С-праймера или G-праймера с одиночной цепью, далее идет ДНКполимеразное образование новой цепи и последующее разделение двух цепей путем нагревания. Это позволяет в ходе реакции амплифицировать удлиненный теломеразой олигонуклеотид. Затем продукты реакции подвергают гель-электрофарезу и получают спектр радиоактивных полос, соответствующих удлиненным олигонуклеотидам. Этот метод является самым высокочувствительным и позволяет определить наличие теломеразы в разных биологических материалах.