Динамика накопления антигенов полевого штамма вируса ящура серотипа азия-1 на перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13

Динамика накопления антигенов полевого штамма вируса ящура серотипа азия-1 на перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13

В настоящее время ящур остается одной из наиболее опасных болезней парнокопытных из-за высокой контагиозности, быстрого распространения и воспримчивости многих видов домашних и диких животных (1). Данная инфекция наносит значительный экономический ущерб хозяйствующим субъектам, который складывается от потери животноводческой продукции, расходов на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий, а также от ограничений коммерческой и хозяйственной деятельности, что приводит к социально-экономичсеким последствиям [2, 3].

Анализ официальных данных МЭБ свидетельствует о довольно напряженной ситуации в мире по данной инфекции. Так, в 2004;2005 гг. неблагополучными по ящуру были 59 стран, в том числе 27 азиатских, 26 африканских и 5 южноамериканских [3, 4, 7].

Возбудитель инфекции относится к мелким вирусам, обладающим высокой антигенной вариабельностью из-за изменения аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков. Такие антигенные изменения могут выражаться от незначительных отличий между штаммами, улавливаемых только с помощью точных методов молекулярного анализа, до появления совершенно отличающихся штаммов, требующих применения новых средств серологической диагностики и специфичсекой профилактики инфекции, вызываемой этими штаммами [1,3,4,5]. В этой связи появление новых вспышек ящура в Казахстане, а также в странах ближнего и дальнего зарубежья должно сопровождаться своевременным выделением возбудителя, изучением его иммунобиологических свойств.

Настоящая работа посвящена изучениюдинамики накопления комплемент связывающих, преципитирующих и виурснейтрализующих антигенов полевого штамма вируса ящура серотипа Азия-1 на первиваемой линии культур клеток.

При выполнении научно-исследовательской работы использован выделенный на территории Казахстана и адаптированный к перевиваемой линии культур клеток ВНК-21/13 штамм «№ 13/КазНИВИ» типа Азия-1.

Для получения биологической массы полевого штамма вируса ящура использовалась перевиваемая культура клеток ВНК-21/13. Штамм вируса репродуцировали стационарным методом в 50 см³ пластиковых матрасах. Культивирование вируса проводили на питательной среде Игла-МЕМ без добавления сыворотки крови животных при температуре 37 °C. Пораженные матрасы замораживали при температуре минус 20 єС и размораживали при комнатной температуре, затем брали пробы для определения комплементсвязывающей, преципитирующей, вируснейтрализующей и биологической активность вируса, а также для определения стерильности на бактериальную и грибковую обсемененности. Инфекционность вируса выражали в Ig ТЦД50/мл и рассчитывали по Риду и Менча.

Очистку биологической массы полевого штамма вируса ящура проводили 2% хлороформом с последующим центрифугированием при 7000 об/мин в течение 45 мин. Инактивацию вирусной суспензии вируса ящура серотипа Азия-1 проводили при температуре 25 єС димером этиленимина в конечной концентрации 0,02% течение 30 часов. Постановку и учет результатов реакций связывания комплемента (РСК), преципитации (РДП) и нейтрализации (РН) проводили согласно методическим указаниям с использованием типоспецифических сывороток против серотипов А, Азия-1 и О.

Изучение и определение времени накопления комплементсвязывающих, преципитирующих и вируснейтрализующих антигенов на клеточной системе имеет практическое значение при разработке технологии изготовления профилактических препаратов и диагностических тест-систем, используемых при индикации и идентификации полевых штаммов возбудителя ящура.

Адаптированным к культуре клеток штаммом вируса ящура «№ 13/КазНИВИ» серотипа Азия-1 инфицировали культуру клеток ВНК-21/13 суточного возраста, без каких-либо деструктивных изменений в монослое. Инфицирование проводили культуральной вируссодержащей суспензией в дозе 0,1ТЦДкл. Инфицированные культуры клеток инкубировали при температуре 37 єС. Для определения динамики накопления комплементсвязывающих, преципитирующих, вируснейтрализующих антигенов полевого штамма проводили микроскопирование монослоя инфицированных клеток и через каждые 3 часа после их заражения замораживали при температуре минус 20 єС, а также в период максимального развития цитопатогенных изменений, характеризующихся появлением округлых, блестящих, преломляющий световой поток клеток с последующим отторжением от поверхности субстрата и образованием пустот на площади 70−80% монослоя, сосуды замораживали при вышеуказанном отрицательном температурном режиме в течение 24 часов и размораживали при 22 °C. Клеточные детриты из вирусной суспензии удаляли путем обработки хлороформом и центрифугированием. Далее полученную вирусную массу использовали в качестве антигена при постановке серологических реакций. Результаты оценки активности и специфичности предлагаемого антигена для серологических реакций при диагностике ящура типа Азия-1 представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видны, что начало накопления комплементсвязывающего антигена отмечено через 3 часа после инфицирования культуры клеток. В данном периоде титр антигена составил 1:2, но в монослое культуры клеток ВНК-21/13 каких либо цитопатогенных изменений, обусловленных возбудителем инфекции, не удалось установить. С увеличением срока культивирования титр комплементсвязывающего антигена прогрессировал и достигал максимума 1:32 через 30−33 часа после инокуляции вируса. В данный период в монослое наблюдали ЦПД, которое охватило около 50−60% клеток монослоя. Изменения характеризовались появлением в монослое блестящих, преломляющих световой поток клеток, которые в последующем отторгались от поверхности стекла, образуя обширные пустоты. После указанного срока культивирования наблюдалось постепенное снижение уровня накопления антигена, достигшего минимального титра к 45 ч. репродукции вируса, хотя в эти сроки цитопатическое действие возбудителя в монослое клеток проявлялось в геометрической прогрессии и характеризовалось появлением округлых, светящихся клеток, преломляющих световой поток с последующим отторжением от поверхности субстрата (стекла).

На следующем этапе экспериментов изучали преципитиногенную активность культурального антигена возбудителя ящура типа Азия-1 в РДП, результаты которой представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, накопление преципитирующего антигена возбудителя ящура типа Азия-1 начиналось через 6 часов после заражения культуры клеток ВНК-21/13, достигая максимального титра 1:8 через 30 часов. Из таблицы также видно, что максимальный титр антигена удерживался в течении 6 часов, после чего происходило снижение титра преципитирующего антигена, и к 54 часам культивирования антиген удалось обнаружить только цельном варианте.

На следующем этапе исследований изучена динамика накопления вируснейтрализующего антигена на культуре клеток. Реакцию нейтрализации ставили согласно методическим указаниям с использованием постоянной дозы специфической сыворотки (титр сыворотки 1:8) и перевиваемой линии культуры клеток ВНК-21/13. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что в начальной стадии репродукции вируса титр вируснейтрализующего антигена был низким, хотя в этот период в монослое наблюдалось начало цитопатогенных изменений. С возрастанием срока размножения возбудителя титры антигена возрастали, достигая максимальных значений между 18 и 36 часами культивирования, о чем свидетельствуют результаты, представленные в таблице. Далее отмечалось плавное снижение титра антигена и высокой цитопатогенной активности вируса на 70−80% монослоя клеток. Инфекционная активность вируссодержащей суспензии, замороженной в вышеуказанном периоде, составила 7,25 lg ТЦД50/см.

Изучение динамики накопления антигенов возбудителя ящура на культуре перевиваемой линии клеток показало, что комплементсвязывающий антиген накапливается через 30−33 часа, преципитирующий — 36−42, а вируснейтрализующий антиген — между 12 и 36 часами после заражения культур клеток в титрах 1:32, 1:8 и 1:16 соответственно. Активность и специфичность антигенов позволяет использовать их в качестве антигена в серологических реакциях при индикации, идентификации и ретроспективной диагностике ящура парнокопытных животных.

• 1. Кругликов Б.А., Штефан М. К., Тарасенко Т. Я. Изучение инфекционных свойств штаммов вируса ящура типа О, выделенных в разные периоды эпизоотии / Акт. пробл. вет. вирусол, — Владимир, 1998. — Ч. 1. — С. 77−78.
• 2. Рёрер X. Ящур /Пер. с нем. Г. А. Сурковой; Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П. В. Малярца, — М.: Колос, 1971. — 432 с.
• 3. Бурдов А.Н., Дудников А. И., Малярец П. В. и др. Ящур /Под ред. Бурдова А. Н. — М.: Агропромиздат, 1990. — 320 с.
• 4. Шажко Ж.А., Фомина Т.А. и др. Некоторые характеристики эпизоотических штаммов вируса ящура, изолированных в СССР /Ящур. (К новой стратегии борьбы с ящуром). — Владимир, 1992, — 4.1.-С. 82−96.
• 5. Сюрин В.Н., Самуйленко А. Я., Соловьев Б.В. и др. Вирусные болезни животных.-М.: ВНИТИБП, 1998. — С. 532−548.
• 6. Методические указания по выделению и идентификации штаммов вируса ящура, — Владимир, 2002, — 27 с.
• 7. Захаров В.М., Рахманов А.М. Разработка программы по борьбе с ящуром в странах СНГ /Акт.пробл. инфекц. патол. ж-ных: Матер. Междунар. науч. конф., посвящён. 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ. — Владимир, 2003. — С. 14−18.
• 8. Муминов Д.М., Фомина Т. А., Егорова А.И. и др. Характеристика изолята вируса ящура типа Азия-1, выявленного в Таджикистане в 2004 году /Пробл. мониторинга и генодиагн. инфекц. болезней ж-ных: Матер. Междунар. науч. конф. молодых учёных, 24 — 26 марта 2004 г. — Владимир, 2004. — С. 8−12.