Эффект взаимодействия целита (SiO2) с мРНК из созревающего зерна кукурузы

Следующим методическим шагом стало осознание того, что хроматография как таковая не является необходимым условием распада мРНК. Главным моментом является инкубация водного препарата магнийсодержащей мРНК при повышенной температуре (высокотемпературная элюция поли-(А)±мРНК с колонки). Дальнейшие исследования показали, что распад мРНК происходит при любой температуре, вплоть до температуры жидкого азота. Распад мРНК происходил как in vitro, при хранении водных растворов РНК, так и in situ, при хранении растительных тканей в жидком азоте [26].

Для изучения судьбы мРНК в ходе аффинной хроматографии была использована молекулярная гибридизация радиоактивномеченых олигонуклеотидных зондов к мРНК зеинов 19 кДа созревающего зерна обычной кукурузы и мутантной по гену opaque-2 с поли-(А)-содержащей мРНК непосредственно на колонке поли-(У)-сефарозы. Для гибридизации (А)n65о/(А)n35о использовали матричные РНК, отличающиеся друг от друга по длине поли-(А)-последовательностей.

Относительную длину терминальной поли-(А)-последовательности — (А)n65о/(А)n35о — оценивали методом ступенчатой термальной элюции мРНК с колонки поли-(У)-сефарозы при 35оС (коротко хвостовые молекулы мРНК) и 65оС (длинно хвостовые молекулы мРНК).

Препараты РНК непосредственно после выделения имели преимущественно длинно хвостовые молекулы поли-(А)+мРНК с соотношением (А)n65о/(А)n35о = 2,4 для обычной кукурузы и 2,2 для о2-кукурузы (мРНК, тип 1). Хранение препаратов суммарной РНК в жидком азоте в течение двух недель приводило к укорочению поли-(А)-последовательностей мРНК и соотношение менялось в сторону короткохвостовых молекул: для нормальной кукурузы оно составляло 0,33, а для о2-кукурузы — 0,24 (мРНК, тип 2). Вероятно, при этих условиях хранения (-195,8оС) не прекращается деятельность ассоциированных с мРНК РНКаз, определяющих деаденилирование и распад, так как один и тот же препарат поли-(А)-мРНК, разлитый на аликвоты, изменялся с течением времени хранения [ 26]. Эта закономерность была характерна и для рРНК [29].

Механизм этого процесса, скорее всего, связан с электронно-конформационными взаимодействиями, активирующими действие ферментов или рибозимных свойств РНК в условиях сверхнизких температур.

Результаты экспериментов позволяли предположить, что процесс дифференциального распада мРНК в ходе аффинной хроматографии определяется ассоциированными с мРНК РНКазами белковой природы. Для доказательства этого факта использовали обработку суммарного препарата РНК типа 1 взвесью целита (SiO2), специфически взаимодействующего с белками. Обработка целитом в этих экспериментах приводила к увеличению выхода поли-(А)+±мРНК только у прогретого препарата суммарной высокополимерной РНК (таблица 1).

Предполагалось, что ассоциированные с мРНК РНКазы белковой природы экранированы вторичной структурой мРНК и это является одной из причин устойчивости ферментов к обработке самыми различными агентами [21, 31].

Таблица 1. Влияние целита на выход поли-(А)++мРНК при аффинной хроматографии РНК из зерна о2-кукурузы на поли (У)-сефарозе [21, 31]