Радиационная обработка медицинской продукции для стерилизации

Введение

Глава 1. Действие ионизирующих излучений на микроорганизмы

1.1 Общее представление о действии ионизирующих излучений на бактериальную клетку

1.2 Чувствительность микроорганизмов к ионизирующим излучениям

1.3 Влияние ионизирующих излучений на свойства микроорганизмов Глава 2. Радиоустойчивость микроорганизмов

2.1 Повышенная устойчивость некоторых бактерий к ионизирующим излучениям в природе и факторы, влияющие на радиорезистентность микроорганизмов

2.2 Концентрация микробных клеток в облучаемом объекте

2.3 Влияние температуры

2.3 Кислородный фактор, влияние питательных веществ, комбинирование

2.4 Облучение малыми дозами Глава 3. Радиационная стерилизация

3.1 Применение радиационной стерилизации

3.2 Стерилизация медицинских изделий из полимерных материалов Глава 4. Эффективная стерилизующая доза и контроль стерильности

4.1 Общие понятия

4.2 Инициальная контаминация объектов, подлежащих стерилизации

4.3 Выбор эффективной стерилизующей дозы

4.4 Контроль стерильности Глава 5. Расчёт защиты камеры облучения, камеры сборки и хранилища

5.1 Расчёт защиты камеры сборки

5.2 Расчёт мощности дозы на выходе из лабиринта камеры Глава 6. Расчёт потока энергии в зависимости от расположения объекта

6.1 Нахождение тройки векторов потока для облучателя

6.2 Нахождение потока проходящего через одну грань

6.3 Нахождение потока проходящего через 2 грани Глава 7. Охрана труда

7.1 Организация охраны труда на предприятии

7.2 Анализ пожароопасности

7.3 Расчет искусственного освещения на ГЩУ Выводы

Введение

Успешное развитие хирургии, терапии и других разделов медицины было бы невозможно без решения проблемы асептики и антисептики, частью которой является стерилизация — убивание микроорганизмов, обсеменяющих окружающий нас живой и неживой мир. Для стерилизации может быть использован принципиально любой агент физической или химической природы, способный убить бактериальную клетку. В медицине и в медицинской промышленности Широко используются два традиционных метода стерилизации: автоклавирование и газовая стерилизация, осуществляемая окисью этилена. Однако автоклавирование при высоких температуре и давлении непригодно для термолабильных материалов, высокочувствительных к температурным воздействиям, и для многих лекарственных препаратов, а высокореактивная химическая окись этилена, взаимодействуя со стерилизуемым материалом, часто приводит к образованию токсических продуктов.

Вскоре после открытия лучей Рентгена стало известно бактерицидное действие ионизирующих излучений. Однако потребовалось более полувека, прежде чем оказалось возможным практическое использование бактерицидного действия радиации для стерилизации.

Стерилизация, производимая с помощью ионизирующих излучений, получила название радиационной, или лучевой стерилизации. Ввиду того, что лучевая стерилизация протекает без высокой температуры, ока была названа также холодной стерилизацией.

Толчком для использования радиационного способа стерилизации в промышленных масштабах послужила необходимость применения различных изделий одноразового использования, особенно шприцев.

Развитие химии полимеров дало возможность получать новые пластмассы и полимерные материалы, позволившие создать новую отрасль медицинской промышленности, производящей различные изделия из этих материалов, используемые в хирургии и других областях практической медицины, в том числе и медицинские изделия одноразового использования (шприцы, катетеры, изделия службы крови и т. п.). Развитие этой отрасли медицинской промышленности обусловило необходимость искать новые способы стерилизации, которые не изменяли бы свойств новых материалов и не ухудшали бы их качеств. Медицине требовались новые изделия из пластмасс, и их стала выпускать медицинская промышленность в огромных количествах, а старые традиционные способы стерилизации уже не могли удовлетворять растущих потребностей в этих изделиях. В ряде случаев радиационная стерилизация явилась единственным из возможных способов обеспложивания. При радиационной стерилизации используются ионизирующие излучения, обладающие высокой понижающей способностью, например, гамма-излучение или электроны с энергией 5- 10 МэВ ускорителей. Радиационной стерилизацией может быть названа также стерилизация ультрафиолетовым излучением. Однако проникающая способность этого вида излучения очень мала, ультрафиолетовое излучение «пробивает» слой воды всего в несколько десятков микрон. Поэтому ультрафиолетовое излучение может быть использовано только для стерилизации поверхностей и непригодно для радиационной стерилизации медицинской продукции в промышленных масштабах.

Благодаря высокой проникающей способности гамма-излучения радиоактивных изотопов и других видов ионизирующего излучения оказалось возможным стерилизовать медицинскую продукцию в уже упакованном и готовом к выпуску виде, что давало дополнительные преимущества способу радиационной стерилизации по сравнению с традиционными способами.

Возникшая ситуация закономерно привела к развитию специального раздела радиационной техники — различных видов облучательных установок лабораторного, опытно-промышленного и промышленного типа. Создание ряда лабораторных и опытно-промышленных установок позволило изучить все аспекты радиационной стерилизации и разработать ее технологию применительно к определенному виду медицинской продукции. Несмотря на то, что радиационная стерилизация внедрена в практику в ряде стран, продолжаются разработка и совершенствование этого способа, расширяется сфера его использования.

Сфера использования радиационной стерилизации в медицине увеличивается, и возникает потребность в знании того, что же представляет собой этот способ стерилизации, каковы его возможности, положительные и отрицательные стороны. Поскольку атомная энергия и радиационная техника с каждым годом находят все большее применение в различных областях науки, техники и народного хозяйства, необходимо разрабатывать вопросы радиационной безопасности при использовании источников ионизирующих излучений в медицинской промышленности, а также вопросы дозиметрии применительно к способу радиационной стерилизации.

Многие закономерности действия радиации на микроорганизмы были получены при изучении влияния ультрафиолетовых лучей. Ограничимсся описанием действия на бактерии только высокопроникающего ионизирующего излучения. Такое ограничение в значительной мере связано с невозможностью использовать ультрафиолетовые лучи для радиационной стерилизации ввиду их малой проникающей способности. В нашу задачу не входило также изучение мутагенного действия ионизирующих излучений на микроорганизмы, так как это является предметом изучения радиационной генетики микроорганизмов, и, кроме того, используемые для радиационной стерилизации дозы излучения рассчитаны на бактерицидный эффект, гарантирующий надежное обеспложивание. При этих дозах мутагенное действие радиации вряд ли может иметь место.

Хотя радиационная химия полимеров, используемых в медицине, является одним из важнейших аспектов проблемы радиационной стерилизации, мы считали возможным не касаться ее, так как имеются монографии и обзоры, вполне освещающие состояние этой области химии. Мы не касались также вопросов оценки простерилизованной продукции по токсичности, пирогенности (способности вызывать температурную реакцию организма) и другим медико-биологическим показателям, так как ограничили себя основными вопросами проблемы — стерилизацией и радиационной техникой, с помощью которой осуществляется процесс стерилизации.

Глава 1 Действие ионизирующих излучений на микроорганизмы.

1.1 Общее представление о действии ионизирующих излучений на бактериальную клетку

Для лучевой стерилизации особенно важно бактерицидное действие ионизирующих излучений, т. е. такое действие, при котором облучение гарантирует убивание бактерий на стерилизуемом объекте. Однако для того чтобы знать какая доза облучения требуется для надежной стерилизации, необходимо иметь представление о чувствительности микроорганизмов к ионизирующим излучениям.

Чувствительность микроорганизмов может колебаться от воздействия ряда факторов. Но основными из них являются: газовая среда, температура вещества, дающие защитный эффект, или, наоборот, повышающие чувствительность бактерий к излучениям, степень гидратации воды. Все эти факторы определяют непрямое действие ионизирующих излучений на бактериальную клетку и зависят от состава питательной среды, на которой росли и размножались бактерии, от возраста культуры бактерий, условий содержания бактерий после облучения и т. д.

В настоящее время изучение радиочувствительности бактерий непосредственно связано с использованием ионизирующих излучений для лучевой стерилизации медицинских изделий и препаратов, для обработки пищевых продуктов и др.

Понятие радиочувствительности определяет наличие противоположного понятия радиорезистентности. Очень часто при описании одного и того же явления используют оба эти термина, не делая различия в их содержании. Под радиочувствительностью, следует понимать способность вещества клетки или какой-либо клеточной структуры взаимодействовать с ионизирующим излучением, результатом чего будут физико-химические изменения вещества и биологические эффекты. Биологические эффекты проявляются в задержке процесса деления клетки и снижении способности размножаться, в нарушениях клеточного метаболизма, повреждениях регуляторных механизмов клетки, видимых морфологических изменениях, гибели клетки. Клетка не однородна в своей радиочувствительности. Например, ядро клетки более чувствительно к ионизирующим излучениям, чем цитоплазма или клеточная оболочка, процессы фосфорилирования более чувствительны, чем весь процесс дыхания клетки и т. д. Если бы репарационные процессы не компенсировали большинства повреждений клетки, вызываемых ионизирующими излучениями, то любое лучевое воздействие приводило бы к гибели клетки. На самом деле этого не происходит благодаря способности клеток восстанавливать радиационные повреждения. Впервые эта способность клеток восстанавливать повреждения, вызванные действием ионизирующих излучений, была обнаружена Г. А. Надсоном в 1926 г. при облучении дрожжей. В последующие годы процессы восстановления клеток после облучения тщательно изучались и сущность этого интересного процесса была детально изучена и затем описана советскими радиобиологами В. И. Корогодиным и В. Д. Жестяниковым.

Для лучевой стерилизации очень важно знать, при каких условиях происходит восстановление облученных микроорганизмов. Прежде всего это связано с дозой ионизирующего излучения и способностью репарировать радиационные повреждения после облучения при наименьшей активности процессов метаболизма в клетке.

Таким образом, радиорезистентность определяется способностью клетки восстанавливать радиационные повреждения.

1.2 Чувствительность микроорганизмов к ионизирующим излучениям

Первое сообщение о бактерицидном действии рентгеновых лучей появилось в 1901 г. В последующие годы в связи с успехами ядерной физики значительно возрос интерес к действию ионизирующих излучений на живую клетку, в том числе и на микроорганизмы.

Все микроорганизмы по их чувствительности к излучениям могут быть распределены в следующем порядке. Наиболее чувствительны бактерии, затем следуют, плесени, дрожжи, споры бактерий и, наконец, вирусы. Однако такое распределение условно, поскольку среди бактерий известны виды, гораздо более радиоустойчивые, чем споры или вирусы.

На радиочувствительность микроорганизмов влияет множество факторов, зависящих от условий, при которых производится облучение, а также генетическая детерминированность самой клетки. К числу факторов, изменяющих чувствительность клетки к радиации, относятся: температура, присутствие кислорода или других газов, состав и свойства среды, в которой производится облучение и т. д. Эти факторы можно менять до облучения, в процессе облучения и после него.

Чувствительность к действию ионизирующих излучений у представителей животного и растительного мира варьирует в значительных пределах. Микроорганизмы отличаются низкой радиочувствительностью по сравнению с животными и растениями. Средние летальные дозы микроорганизмов превышают средние летальные дозы животных на 1−2 порядка. Если для животных эти дозы равны 4 — 3 Гр, то для бактерий они увеличиваются до 50 — 500 Гр и выше. В ряде случаев бактерицидный эффект для культуры бактерий может быть достигнут только при облучении в дозах порядка 10 — 20 кГр [7 — 8].

Исследования, проведенные в 50-х годах, накопили большое количество фактов о радиочувствительности микроорганизмов, о дозах ионизирующих излучений, вызывающих бактерицидный эффект и инактивацию различных видов и штаммов бактерий. Так, было показано, что доза 50 Гр резко снижает выживаемость кишечной палочки, а доза 200 Гр убивает 95% бактерий. По данным Gunter и Kohn [10], культура микроорганизмов каждого вида содержит смесь клеток, различных по радиочувствительности. Например, для 66% клеток культуры кишечной палочки 50% летальная доза соответствовала 12 Гр, а для 34% бактерий ДЛ₅₀ составляла 35 Гр. Субкультуры как более радиоустойчивых клеток, так и менее радиоустойчивых давали смешанные популяции, в которых содержались клетки, различные по чувствительности к действию радиации.

При облучении бактерий кишечной группы гамма-лучами инактивация их происходит в пределах доз от 0.240 до 1.68 кГр. Гибель всех клеток культуры бактерий кишечной палочки происходит при дозах около 300 000 Р. Если кишечная палочка находится в смеси с микроорганизмами, образующими споры, то доза облучения, убивающая споры (от 2 000 000 до 3 000 000 Р), убьет и кишечную палочку. При воздействии на кишечную палочку и другие микроорганизмы, находящиеся в почве, гамма-нейтронного излучения атомного реактора при плотности потока нейтронов, составляющей 0,6 * 10¹¹? 1,4 * 10¹² нейтр./см² в 1 секунду в течение 2−20 минут, погибало до 100% всех неспоровых форм и 75−99% споровых форм бактерий. Радиочувствительность кишечной палочки к рентгеновым лучам и к бета-излучению почти одинакова и не изменяется при облучении электронами высоких энергий в дозах, эквивалентных рентгенам. При облучении взвеси бактерий в буферном растворе средняя летальная доза бета-излучения равнялась 60 Гр для кишечной палочки. При облучении высушенной культуры этих же бактерий средняя летальная доза повышалась до 200 Гр. Изучалось также действие бета-излучений от радиоактивных изотопов на кишечную палочку, дизентерийные бактерии, золотистый стафилококк и В. subtilis. Так же как и при облучении рентгеновыми или гамма-лучами, наиболее устойчивыми к действию этого вида излучения оказались споры [17, 18, 19]. По данным М. А. Туманян [18], бактерицидное действие радиоактивного фосфора Р³² в отношении кишечной палочки и дизентерийных бактерий Флекснера проявлялось при концентрации, равной 300 мКю.

По чувствительности к действию ионизирующих излучений бактерии брюшного тифа близки к кишечной палочке. Одним из первых признаков лучевого воздействия на бактериальную клетку культуры брюшнотифозных бактерий является потеря подвижности [20, 21]. Исследование влияния радиации на двигательные функции подвижных организмов показало, что облучение в дозах 2 — 4 и 8 кГр не влияло на подвижность микроорганизмов. Двигательная функция В. subtilis, холерного вибриона, кишечной палочки, Proteus vulgaris, Proteus OX₂, возбудителей брюшного тифа и паратифа В и Ps. aeruginosa не изменялась. По-видимому, белковый двигательный компонент этих микроорганизмов мало чувствителен к ионизирующим излучениям или клетки микроорганизмов обладают механизмом внутриклеточной защиты двигательных центров. Под влиянием радиоактивных веществ — Ро²¹⁰ и Sr⁹³, присутствующих в растворе в высоких концентрациях (2*10^-5? 2*10^-з Ки/л), брюшнотифозные бактерии оставались жизнеспособными в течение нескольких месяцев. Было показано также, что чем выше концентрация микробных клеток во взвеси, тем выше количество выживших бактерий. По нашим данным, доза 1 кГр обеспечивала бактерицидный эффект в отношении брюшнотифозных бактерий, штамм Ту₂4446, при концентрации 1 млрд. микробных тел в 1 мл взвеси в физиологическом растворе. Радиочувствительность бактерий дизентерии Флекснера не отличалась от чувствительности брюшнотифозных бактерий к действию рентгеновых или гамма-лучей. Однако в ряде случаев эта доза облучения убивала не все клетки культуры бактерий; бактерицидный эффект излучения для 100% клеток наблюдается только при повышении дозы до 4 — 6 кГр. Для сибиреязвенных микробов летальное действие радиации наблюдалось при дозах 3 — 5 кГр.

Туберкулезные микобактерии более устойчивы к действию ионизирующих излучений по сравнению с бактериями кишечной группы и сибиреязвенными. Бактерицидное действие на них гамма-излучения обнаруживалось при дозах 7 кГр — 10 кГр. Облучение в дозах 1 — 2 кГр не влияло на рост бактерий. Повышение дозы до 4 — 5 кГр снижало вирулентность этих бактерий, а дозы 5 — 10 кГр снижали аллергеногенные свойства микобактерий.

Таким образом, для получения одинакового биологического эффекта у различных видов микроорганизмов требуются различные дозы излучения. Эти различия зависят от ряда биологических особенностей облучаемых бактерий, условий облучения, влияния среды, в которой облучаются микроорганизмы, и других факторов. Особое значение придается неодинаковой чувствительности нуклеинового обмена и ДНК различных микроорганизмов к излучению. Значительно варьирует чувствительность бактерий к радиации и внутри одного и того же вида, штамма и даже популяции бактериальных клеток. Популяция клеток состоит из бактерий, располагающихся по устойчивости к радиации в вариационный ряд, так же как и по другим биологическим признакам. Поэтому в популяции всегда присутствуют особо радиорезистентные клетки. Для того чтобы их убить, необходимо облучение в значительно более мощных дозах, чем те, при которых погибает основная масса клеток, менее резистентных к облучению.

Грамположительные бактерии менее чувствительны к облучению, чем грамотрицательные. Примером высокой радиорезистентности грамположительных бактерий могут служить сарцины. Как пигментные сарцины (S. aurautica, S. lutea), так и бесцветная (S. ureal) обладают высокой устойчивостью к бактерицидному действию рентгеновых и ультрафиолетовых лучей. По данным 3. Г. Першиной и Т. Д. Есаковой [17], взвесь сарцин густотой в 40 млрд. микробных тел в 1 мл погибала при облучении гамма-излучением в дозе 15 кГр.

Значительно более высокой устойчивостью к действию ионизирующих излучений обладают споры бактерий [14, 19, 22, 31]. Бактерицидный эффект радиации из споры в подавляющем большинстве случаев проявлялся при дозах облучения не ниже 10- 20 кГр. Для полной инактивации спор, по данным Hannan [32], Kuprianof [33], Nickerson с соавторами [34], В. Л. Троицкого и др. [35], нужны дозы порядка 15−20 кГр, а по данным М. Н. Мейселя и Н. Д. Черняева [36], эта доза должна быть увеличена до 25 кГр. Споры В. subtilis убиваются гамма-излучением в дозах от 15 до 20 кГр [12, 13, 37]. Такие же большие дозы нужны для убивания Clostridium sporogenes, Candida albicans, Aspergillus niveus и других видов микроорганизмов. Споры Clostridium botulinum оказались особенно радиорезистентными. Облучение образцов почв в дозе 10 кГр приводило к отмиранию клеток азотобактера, к снижению количества актиномицетов и не влияло на выживаемость спор клостридиа [38, 39]. При облучении спор С1. botulinum (штамм ЗЗА) гамма-излучением в дозах от 10 до 90 кГр зависимость между дозой облучения и гибелью спор характеризовалась экспоненциальной кривой, хотя для спор экспоненциальная зависимость проявляется при дозах облучения до 30 кГр.

Радиочувствительность спор различных бактерий варьирует в значительно меньшей степени, чем радиочувствительность различных видов бактерий, не образующих спор. Прорастающие споры более чувствительны к действию рентгеновского или гамма-излучения по сравнению с покоящимися спорами. Так, прорастающие споры В. megatherium в 3 раза более чувствительны к действию излучений, чем покоящиеся споры. Такое изменение радиочувствительности прорастающих спор связывают с биохимическими изменениями, происходящими в это время. Так, резкое повышение радиочувствительности прорастающих спор В. cereus связывают с увеличением содержания воды в живой клетке. Вегетативные клетки спорообразующих бактерий более чувствительны к действию радиации, чем споры. По радиочувствительности они мало отличаются от видов бактерий, не образующих споры. Изучение микрофлоры мясных продуктов, подвергавшихся лучевой обработке, показало, что полная инактивация живых клеток достигается для стафилококка и вегетативных клеток В. cereus дозами 1.50 кГр для кишечной палочки нужна доза 2 кГр, для Salm. typhimurium и Str. faecalis 3 кГр, а для спор В. cereus и Cl. bitermentaus инактивирующая доза повышалась до 20 кГр. Таким образом, радиочувствительность вегетативных форм В. cereus выше или не отличается от радиочувствительности неспорообразующих видов микроорганизмов и более чем в 10 раз выше радиочувствительности спор этих же бактерий.

Если бы споры были наименее радиочувствительными представителями микроорганизмов, то свойства радиочувствительности или радиоустойчивости можно было бы объяснить только биологическими особенностями, характеризующими спору. Однако среди микроорганизмов, не образующих спор, известны такие, которые отличаются чрезвычайно высокой радиорезистентностью, в ряде случаев превышающей радиорезистентность самых устойчивых спор. Эти высокорадиорезистентные микроорганизмы чаще всего встречаются среди кокков и сарцин. Известны микрококки, у которых полулетальная доза равна 4 кГр. По данным Ф. С. Апт с соавторами, при лучевой стерилизации мяса, рыбы и других консервированных продуктов наиболее часто после облучения в дозах от 6 до 15 кГр обнаруживали кокков. Большей частью это были грамположительные диплококки, выдерживавшие облучение в дозе 15 кГр. Примером высокой радиорезистентности могут служить бактерии, выделяемые из вод атомных реакторов. Эти бактерии выдерживают воздействие огромных доз ионизирующей радиации. Бактерии, выделенные из реактора в лаборатории в Лос-Аламосе (США), принадлежали к виду Psеudo-monas. Доза облучения, которому подвергались эти бактерии, составляла 100 кГр за 8 часов, В Австралии бактерии были обнаружены в тяжелой воде реактора. Они размножались, несмотря на то что тяжелая вода токсична для бактерий.

Выделенные 3.Г. Першиной с соавторами из воды реактора грамм-положительные палочки отличались высокой устойчивостью к облучению. Доза 15 кГр не убивала всех бактерий в культуре. Бактерии обладали способностью образовывать красноватый пигмент.

Применение ионизирующей радиации для стерилизации пищевых продуктов и других материалов показало, что облучение в дозах 20 — 30 кГр убивает 99,9% микроорганизмов в стерилизуемом объекте. Однако 0,05−0,1% микроорганизмов остаются живыми. Эти неубитые микроорганизмы оказались высокорадиорезистентными кокками, и для полной стерилизации пищи и других материалов приходилось применять дозы значительно выше 20 кГр. Anderson и соавторы изолировали эти радиорезистентные кокки и изучили их свойства. Чистая культура на агаре этих микроорганизмов, идентифицированных как Micro-coccus roseus и Micrococcus tetragenus, выдерживала облучение 60 кГр. Устойчивость их к радиации была в 6−8 раз выше устойчивости спорообразующих микроорганизмов.

Данные о радиочувствительности фагов и вирусов, различных по величине, имеют большое значение для выяснения первичного механизма действия ионизирующих излучений на клетку. Эти данные используются для подтверждения теории мишени. Таким образом, бактерии и вирусы отличаются высокой радиорезистентностью от всех других видов организмов. По степени радиорезистентности их можно расположить в следующем порядке: бактерии, вирусы, споры. Однако среди бактерий встречаются виды, обладающие такой же высокой радиорезистентностью, что и споры или даже превышающей радиорезистентность спор. Вегетативные клетки споровых видов бактерий и прорастающие споры по радиорезистентности не отличаются от бактерий. Радиочувствительность микроорганизмов и вирусов зависит от целого ряда причин. К числу факторов, влияющих на чувствительность микроорганизмов к действию ионизирующих излучений, относятся: концентрация микробов в облучаемом объекте, фазы роста микроорганизмов, мощность дозы и плотность ионизации, температура при облучении и после него, кислородный эффект, питание, влияние радиопротекторов и др.

1.3 Влияние ионизирующих излучений на свойства микроорганизмов

Исследуя радиочувствительность или радиорезистентность бактерий, обычно наблюдают конечные этапы биологического эффекта радиации на клетку и изучению подвергают объекты, которые являются результатом уже имевшего место лучевого воздействия. Ионизирующие излучения, кроме бактерицидного действия, оказывают мутагенный эффект, результатом которого может быть образование мутантов — особей с измененными и наследственно закрепленными свойствами, отличающими мутант от исходных клеток, или гибель клетки. Под действием ионизирующих излучений и ультрафиолетового облучения в бактериальной клетке могут возникнуть также изменения, которые исчезают после нескольких пассажей в питательную среду. Мутагенное действие ионизирующих излучений (генетический механизм) и действие, не вызывающее наследственно закрепленных изменений, приводят к изменениям биохимии бактериальной клетки и к морфологическим изменениям в ней. Эти изменения не связаны с делением клетки и могут быть отнесены к физиологическому механизму.

Радиационная генетика микроорганизмов, изучающая мутагенное действие ионизирующих излучений, в настоящее время представляет собой большую и успешно развивающуюся область биологии. Имеется несколько монографий как советских, так и зарубежных исследователей, в которых подробно описано мутагенное действие радиации на живые клетки, в том числе и на бактерии, и представлены современные взгляды на механизмы мутагенного действия ионизирующих излучений. Это избавляет от необходимости излагать эту область действия ионизирующих излучений на бактерии тем более, что при лучевой стерилизации надо стремиться к получению бактерицидного эффекта и хорошо знать, что доза, недостаточная для убивания микроорганизмов, может обусловить появление особей с повышенной радиорезистентностью. Повышение радиорезистентности бактерий в результате недостаточной дозы облучения или малой мощности дозы, или дробного облучения, или мутации, снижает эффективность лучевой стерилизации.

Как известно, ядро и цитоплазма различаются по чувствительности к действию ионизирующих излучений. Более радиочувствительны ядро и хромосомный аппарат ядра. Поражение ядра клетки приводит к глубоким изменениям и к потере важных генетических структур, что нарушает нормальные функции клетки и может привести к гибели организма. Функциональные и морфологические изменения микроорганизмов, наступающие в результате действия ионизирующих излучений, многообразны. При изучении действия ионизирующих излучений и ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы особенно четко проявляется подавление функции деления клеток.

Подавление деления при продолжающемся росте клеток приводит к образованию удлиненных нитевидных форм, а при облучении кокков к образованию длинных цепочек. Наблюдается появление длинных нитей и при облучении патогенных бактерий, например возбудителей брюшного тифа, холеры и др. Нитевидные формы бактерий менее резистентны к облучению по сравнению с нормальными клетками, и образование их свидетельствует о деградации штамма и его постепенной гибели. В тех случаях, когда не наблюдалось подавления функции деления клеток под влиянием облучения, иногда изменялись размеры клеток. В некоторых случаях значительно увеличивались средние размеры клеток и появлялись гигантские клетки. Иногда, наоборот, появлялись клетки, у которых средние размеры были меньше, чем у клеток, не подвергавшихся лучевому воздействию. Замедление и подавление функции размножения, и появление нитевидных удлиненных клеток приводят к замедлению роста колоний и к изменению их формы и величины.

Наблюдалось образование шероховатых R-колоний. Описаны изменения цвета и прозрачности колоний, и появление свойства трудно сниматься, с поверхности питательной среды, а также образование окрашенных колоний, имеющих складчатую форму, или колоний слизистого типа. Характерны изменения ядер или ядерного вещества в клетках микроорганизмов. Отмечаются разнообразные дегенеративные изменения в ядре. При действии на различные микроорганизмы (бактерии, амебы) описывают гипертрофию ядра, вакуолизацию, разбухание и разжижение его, увеличение всех ядерных структур клетки. Под влиянием ионизирующих излучений и ультрафиолетовых лучей наблюдается также пикноз ядер у различных микроорганизмов с последующим распадом ядра и его истинный или кажущийся фрагментоз. Под влиянием ионизирующего или ультрафиолетового излучения или радиомиметиков у бактерий и других микроорганизмов наблюдали агрегацию ядерного хроматина в центре клетки вдоль ее оси, а затем переход хроматина в диффузное состояние и его исчезновение.

Эти изменения ядра или нуклеоидов в большинстве случаев приводят к гибели клетки. Если же клетка продолжает существовать, то многие ее свойства и функции претерпевают существенные изменения. Например, бактерии меняют тинкториальные свойства. Так, стафилококки или бактерии кишечной группы изменяют присущее им свойство окрашиваться по Граму положительно или отрицательно. После окраски по Граму культуры бактерий, подвергавшихся лучевому воздействию, очень трудно определить, какую окраскуграмположительную или грамотрицательную — приобрели стафилококки или возбудители брюшного тифа Некоторые микроорганизмы приобретают способность к пигментообразованию.

Изменяются и такие характерные свойства, которые служили видовым признаком, что затрудняет идентификацию бактерий. Таким признаком является, например, способность ферментировать сахара. Однако эта способность изменяется в зависимости от дозы облучения. Небольшие дозы до 0,1 кГр либо не изменяют, либо стимулируют обмен веществ клетки, процессы дыхания и ферментативную активность. При увеличении дозы облучения бактерии теряли способность разлагать некоторые углеводы, Например, А. М. Пасечник и соавторы при облучении Вас. perfringens наблюдали утрату способности сбраживать лактозу или сахарозу, или оба сахара. 3. Г. Першина и соавторы показали, что при больших дозах облучения порядка десятка кГр дизентерийные бактерии Флекснера теряли способность ферментировать маннит, а ферментативная способность брюшнотифозных бактерий значительно снижалась. Ферментативная активность бактерий под влиянием больших доз снижается. Например, снижается сахаролитическая и протеолитическая способность стафилококков или способность к образованию лактозы лизогенными и фагочувствительными штаммами кишечной палочки. Изменения в ядре или в нуклеоидах микроорганизмов, изменения ферментативной активности клеток и тинкториальной способности бактерий связаны с общими нарушениями обмена веществ в клетке, с угнетением синтеза ДНК и др. У облученных бактерий изменялась чувствительность к антибиотикам. По данным 3. Г. Першиной и соавторов, у дизентерийных и брюшнотифозных бактерий повышалась чувствительность к пенициллину. Отмечалось также повышение чувствительности и других видов бактерий (кишечная палочка стафилококки) к пенициллину, ауреомицину и тетрациклину.

Изменению подвергается и способность различных бактерий агглютинироваться специфическими сыворотками. Так, например, у Salm. typhi abdominalis снижается способность давать реакцию агглютинации с противобрюшнотифозной сывороткой. Это свойство связано с изменением антигенной структуры клеток. Обычно измененные свойства сохраняются только в тех случаях, когда имеются глубокие изменения антигенной структуры клеток, Если облучение не вызывает таких глубоких изменений антигенной структуры, то постепенно через несколько пассажей способность агглютинироваться специфическими сыворотками восстанавливается у облученных бактерий. Интерес представляют изменения вирулентности микроорганизмов и их способность образовывать токсины. Эти изменения могут быть стойкими, закрепленными наследственно, и тогда можно говорить о мутационных изменениях, возникающих при действии ионизирующих излучений или ультрафиолетовых лучей. Такие авирулентные мутанты могут быть использованы для приготовления живых вакцин. Однако наблюдается изменение вирулентности бактерий и их способности к токсинообразованию и при таком облучении бактерий, когда не возникает мутаций. И в том, и в другом случае изменения идут в сторону снижения этих свойств. Вместе с тем имеются работы, указывающие на возможность повышения вирулентности некоторых бактерий при сравнительно малых дозах облучения, от нескольких Гр до 5 кГр.

Таким образом, трудно назвать функции и свойства микроорганизмов, которые не подвергались бы изменениям (стойким или исчезающим при дальнейшем культивировании) под влиянием ионизирующих излучений. Глубина этих изменений и их множественность зависят от биологии микроорганизма и от доз радиации. Знание того, какое влияние ионизирующие излучения оказывают на свойства микроорганизмов, необходимо при радиационной стерилизации. Особенное значение это имеет при определении стерильности после облучения. Подавление функции деления клеток, замедление размножения или потеря способности агглютинироваться специфическими сыворотками после облучения могут явиться причиной неправильного ответа о стерильности объектов. Знание же этих изменений определит методы выявление облученных микроорганизмов и позволит избежать ошибки при выдаче ответа о стерильности.

Глава 2 Радиоустойчивость микроорганизмов

2.1 Повышенная устойчивость некоторых бактерий к ионизирующим излучениям в природе и факторы, влияющие на радиорезистентность микроорганизмов

Кроме спор, которые отличаются высокой устойчивостью к ионизирующим излучениям, известны высокорадиорезистентные бактерии, не образующие спор. Высокорадиорезистентные бактерии чаще всего встречаются среди кокков. Поверхность различных изделий медицинского назначения, а также воздух помещений, где эти изделия производятся, бывают загрязнены различными бактериями, в том числе сарцинами, которые отличаются особенно высокой устойчивостью к ионизирующим излучениям. К коккам относится и хорошо известный Micrococcus radiodurans, изолированный из облученного мяса Anderson с соавторами. Спектрофотометрический анализ пигмента радио устойчивых микрококков, выделенных Anderson, показал, что большинства пигментов — каротеноиды. Пигменты, изолированные из радиоустойчивых клеток, были чувствительны, к облучению. Однако высокой радиорезистентностью обладали и беспигментные варианты микрококка [137]. В дальнейшем микрококк, выделенный Anderson, привлек внимание радиобиологов и получил название Micrococcus radiodurance. Он был более устойчив не только к действию рентгеновых лучей или гамма-излучения, но и к облучению ультрафиолетом. Микрококк оказался в 3 раза более устойчивым к ультрафиолетовым лучам, чем кишечная палочка. Для задержки синтеза ДНК в клетках микрококка требуются доли, в 20 раз более высокие, чем те, которые вызывают аналогичный эффект у кишечной палочки.

Можно предположить, что высокая радиорезистентность микрококка связана с особой системой репарации поражений, вызываемых облучением. Отмечена различная природа репараций повреждений Micrococcus radiodurnnce, возникающих в результате ультрафиолетовых облучений и действия ионизирующих излучений.

Высокорадиорезистентные бактерии были выделены из пыли предприятий, производящих медицинские изделия из пластмасс в Дании Christensen с соавторами [139], Это были Streptococcus Faccium., оказалось, что радиорезистентность различных штаммов одного и того же вида микроорганизмов значительно варьирует. Так, для большинства штаммов Sir, faecium доза 20 — 30 кГр является бактерицидной, и лишь единичные штаммы выдерживают облучение в дозе 40 кГр. Штаммы Str. faecium, выделенные из пыли, оказались более радиорезистентными. Хотя большинство штаммов погибало при облучении в дозах от 20 до 30 кГр, однако некоторые штаммы (4 из 28 исследованных) выдерживали облучение в дозе до 45 кГр.

2.2 Концентрация микробных клеток в облучаемом объекте

Одной из причин, играющей существенную роль в эффективности лучевой стерилизации, является концентрация микробных клеток в облучаемом объекте.

В 1951 г, Hollander и соавторы установили, что чувствительность бактерий к облучению является функцией концентрации клеток. С уменьшением концентрации в облучаемой суспензии увеличивается её радиочувствительность 10⁷ клеток являлись оптимальной концентрацией бактерий, при которой действие ионизирующих излучений было наиболее эффективным, Многие исследователи отмечали, что стерилизующий эффект облучении зависит как от доли облучения, так и от густоты и объема облучаемой взнеси (7, 36, 75, 141 — 143). При облучении Е. coli бета-лучами от ускорителя Ван-де-Граафа (2 МэВ) было установлено, что абсолютно стерилизующая доза зависит только от концентрации облучаемой суспензии. Между концентрацией микробов и дозой, убивающей 100% клеток, существует прямая пропорциональная зависимость: чем меньше густота облучаемой взвеси, тем меньше доза облучения, дающая полный бактерицидный эффект.

Рисунок 2.1 — Кривые инактивации различных микроорганизмов.

1 — M. radiodurans R; 2 — Staphylococci; 3 — Micrococci; 4 — Coryneform rod; 5 - Spores; 6 — Str. faecium.

При облучении культуры бактерий кишечной палочки стерилизующее действие гамма-излучения для сравнительно негустых взвесей (8*10⁵—10⁸ микробных тел на 1 мл) было достигнуто при дозе 2 кГр. Облучение более густой микробной взвеси, содержащей 10¹⁰ микробных тел на1 мл в дозе 2 кГр не давало бактерицидного эффекта. Даже при облучении в дозе 4 и 5 кГр иногда наблюдался рост единичных колоний. Полная стерилизация взвесей, содержавших 10¹⁰ и 2*10¹⁰ микробных тел в 1 мл, была достигнута лишь при облучении в дозе 6 кГр. Дальнейшее увеличение количества микробных тел в 1 мл облучаемой среды не требовало повышения дозы облучения для полного бактерицидного эффекта. Так. взвесь дизентерийных бактерий Флекснера в концентрации 7*10¹⁰ микробных тел в 1 мл была полностью инактивирована дозой 6 кГр. К наиболее радиоустойчивым микроорганизмам относится сарцина. При облучении густых взвесей различных микроорганизмов, как более радиоустойчивых, так и менее радии устойчивых, в дозах 1, 2, 4, 8 кГр и 15 кГр наблюдалась зависимость. между снижением количества выживших микроорганизмов и повышением дозы облучения. Чем выше доза облучения, тем меньшее количество микроорганизмов выживало после облучения. Полное стерилизующее действие было достигнуто при облучении микроорганизмов в концентрации 4*10¹⁰ млрд. микробных тел в 1 мл при дозе 15 кГр. Эта доля убивала и наиболее устойчивых, микроорганизмов — сарцину и сенную палочку.

Таким образом, увеличение концентрации микроорганизмов в облучаемом объекте повышает их радиоустойчивостъ. Это положение справедливо для микроорганизмов с различной радиочувствительностью.

Однако увеличение радиоустойчивости облучаемой взвеси не является следствием формирования радиоустойчивости у облученных клеток. После облучения густых взвесей в бактерицидных дозах выживают единичные особи, образующие колонии микробов при высеве на агар. Изучение радиочувствительности этих выживших бактерий показало, что они не стали более устойчивыми к облучению по сравнению с исходной культурой бактерий. Это явление может иметь место при облучении взвесей микроорганизмов значительно меньшей густоты. Оно известно в литературе под названием «хвостон» [35, 146, 40]. Изучение хвостов также показало, что выжившие после облучения в смертельных дозах бактерии не обладают повышенной радиочувствительностью. Объяснение наблюдаемым явлениям следует искать среди причин, обусловливающих гибель микроорганизмов от ионизирующих излучений. Наиболее вероятной причиной повышения радиоустойчивости микроорганизмов при увеличении концентрации является уменьшение парциального давления делящихся клеток. Во время деления клетки ядро становится более уязвимым к облучению [150, 160, 161].

2.3 Влияние Температуры

Изменение температуры в период облучения микроорганизмов, температурные условия, при которых бактерии выращивались до облучения и температура инкубации бактерий после облучения играют существенную роль в бактерицидном эффекте радиации [28,164—I60]. Температура признается одним из важнейших факторов, имеющих значение для инактивации бактерий ионизирующими излучениями При облучении E. coli ультрафиолетовыми лучами и выращивании бактерий до облучения при +4°, +20° и оптимальной для выращивания кишечной палочки температуре оказалось, что низкая температура увеличивает устойчивость бактерий к облучению и повышает способность их к последующей реактивации. Снижение температуры взвесей палочки до и в течение облучения до температуры жидкого азота (—196°) вызывало очень сильное уменьшение количества инактивированных клеток в сравнении с результатами, полученными при температуре 0°. Выращивание Е. coli при температуре +40° вызывало образование удлиненных форм бактерий и повышение их радиорезистентности [171]

Значение температурных влияний на радиочувствительность бактерий особенно сильно сказывается после облучения. При хранении облученных Е. coli в течение нескольких часов при температуре 18° число выживших бактерий гораздо больше, чем при более низкой температуре, равной 6ъ. Хранение Е. coli после облучения при оптимальной для роста бактерий температуре, рапной 37°, так же как и при 6°, снижает их устойчивость к облучению. Однако инкубация Е. coli, облученных ультрафиолетовыми лучами при температуре от 30ъ до 40ъ, повышает радиорезистентность бактерий в 300 раз. Такое повышение радиорезистентности при повышении температуры инкубации наблюдается не у всех штаммов кишечной палочки. В большинстве случаев радиорезистентность бактерий увеличивается, а 3 — 4 раза. Такие же результаты были получены и в опытах с дрожжами.

Таблица 2.1 Действие облучения и тепла на выживаемость Staph. Aureus B-445

Рисунок 2.2 — Влияние температуры инкубации Е. coli, засеянной после облучения па синтетическую питательную среду в питательный бульон

1 — питательный бульон:2 — синтетическая среда.

Данные о влиянии температурного фактора на радиорезистентность микроорганизмов имеют значение для разработки режимов облучения различных медицинских, изделий, лекарственных веществ и биологических тканей, подлежащих радиационной стерилизации, а также при радиационной обработке пищевых продуктов с целью удлинения срока хранения их. Следует учитывать, что в диапазоне от 0° до 40° температура не оказывает влияния на радиорезистентность бактерий к облучению. Замораживание повышает резистентность бактерии к облучению, а облучение при температуре выше 40^е значительно снижает радиорезистентность микроорганизмов, в том числе и отличающихся высокой радиорезистентностью.

2.3 Кислородный фактор, влияние питательных веществ, комбинирование

Роль, кислородного фактора в реакциях, вызванных в микробных клетках действием ионизирующей радиации, показана многими исследователями [140, 109, 193—195]. Было установлено, что чувствительность кишечной палочки к действию ионизирующих излучений значительно выше при присутствии кислорода, чем в присутствии азота [140], Такие же результаты были получены при облучении Е. coli, B. subtilis, Cl. sporogenes. Так же изменялась радиорезистентность Е. coli Вг., дизентерийных бактерий Флекснера и гаплоидных дрожжей при облучении в присутствии кислорода. Механизм кислородного эффекта меняется в зависимости от присутствия кислорода во время облучении или после него. По данным Ховард-Флендерс [194], кислород заметно усиливает действие радиации при хранении микроорганизмов в атмосфере кислорода после облучения их в безкислородной среде. При этом кислород соединяется со свободными радикалами, образовавшимися при облучении культуры бактерий, и образует комплексы, смертельные для клеток. Азот препятствует образованию этих ядовитых комплексов и его присутствие не дает возможности проявиться кислородному эффекту. Таким образом, присутствие кислорода при облучении микроорганизмов или добавление ого после безкислородного облучения оказывает существенное влияние на радиорезистентность микроорганизмов, значительно ее снижая.

Физиологическое состояние наряду с другими факторами в значительной мере определяет радиочувствительность микроорганизмов, В свою очередь потребление питательных веществ влияет на физиологическое состояние микроорганизмов. Поэтому питание можно отнести к числу факторов, от которых зависит радиочувствительность или радиорезистентность клеток. Голодание в большинстве случаев снижает резистентность различных микроорганизмов к ионизирующей радиации и облучению ультрафиолетом При облучении дрожжей, выращенных в условиях голодания, наблюдалось снижение их чувствительности к действию ионизирующих излучений, что проявлялось при увеличении процента гибели клеток после облучении [197, 198]. Более поздние данные показали, что голодание не влияло на различные функции дрожжевой клетки при облучении. Например, как у «голодавших», так и у «неголодавших» обличенных дрожжей Sacch. cerevisiae интенсивность процесса выделения СО₂ одинакова. Голодание повышало чувствительность дрожжей и к ультрафиолетовому облучению. При этом азотное голодание обусловливало повышение чувствительности дрожжей к ультрафиолетовому облучению больше, чем: углеводное голодание.

Выращивание кишечной палочки, паратифозных Б бактерий и золотистого стафилококка на среде с дрожжевым экстрактом в присутствии радиоактивного фосфора в концентрации до 500 мкКи в 1 мл не оказывало влияния на развитие бактерий. Радиоактивный фосфор в таких же концентрациях тормозил развитие бактерии, если этих же бактерий выращивали на питательных средах, не содержавших дрожжевого экстракта.

Таким образам, влияние питания на радиорезистентность микроорганизмов — факт, подтвержденный многочисленными данными, полученными в опытах па различных микроорганизмах. Повышение радиочувствительности микроорганизмов, выращенных до облучения в условиях голодания, и большая радиочувствительность микроорганизмов, облученных в голодных питательных средах, может быть обусловлена отсутствием в «голодавших» клетках и в голодных питательных средах веществ, обусловливающих радиозащитный эффект. Кроме того, в «голодных» питательных средах, по-видимому, отсутствуют необходимые вещества, благоприятно действующие на синтез новых ферментов белковой природы, которые стимулируют восстановление жизнедеятельности микроорганизмов.

При определении чувствительности отдельных особей одной микробной популяций, даже полученной из одной микробной клетки, наблюдается неоднородность состава бактерий по чувствительности к тому или иному воздействию. По своей устойчивости к ионизирующей радиации, равно как и по другим биологическим признакам, популяция микробных клеток состоит из бактерий, располагающихся в вариационный ряд. Следовательно, в каждой популяции имеется определенное количество клеток, особенно устойчивых к облучению. В такой же вариационный ряд располагаются клетки микробной популяции и в отношении другого воздействия — одного из компонентов комбинации. Если эти факторы являются неодинаковыми по механизму действия, то можно предположить, что клетки, наиболее устойчивые к одному из факторов, окажутся более чувствительными к другому. Очевидно, что механизм действия факторов, которые могут использоваться в комбинации с облучением, для усилении бактерицидного действия ионизирующей радиации, должен отличаться от механизма действия излучения.

Наряду с веществами, которые в комбинации с облучением снижают радиорезистентность микроорганизмов, имеется большое количество разнообразных химических соединений, известных как радиопротекторы, которые предохраняют клетку от повреждающего действия ионизирующих излучений или снижающих это действие. Существует несколько классификаций радиозащитных веществ [217, 218]. Наиболее распространенная классификация принадлежит З. Баку и П. Александеру [19З]. Согласно этой классификации все защитные вещества разделены на 7 групп:

— цианиды и нитрилы;

- вещества, содержащие сульфгидрильные группы;

— амины, аминокислоты, пептиды;

— половые гормоны;

— вещества, вызывающие аноксию, и прочие вещества;

— хелатообразующие агенты:

— вещества медленного действия, вызывающие физиологические изменения.

При лучевой стерилизации медицинской продукции, различных лекарственных препаратов, биологических тканей и т. п, необходимо учитывать, что бактерицидное действие ионизирующих излучений. может быть снижено благодаря присутствию в облучаемых объектах веществ, обладающих радиозащитными свойствами. Как видно из выше приведенной классификации, радиоротективные свойства характеризуют многие вещества, поэтому их надо знать и иметь в виду при выборе эффективной стерилизующей дозы облучения для того или иного вида медицинской продукции, подлежащей лучевой стерилизации.

2.4 Облучение малыми дозами

Облучение малыми дозами ионизирующих излучений при однократном воздействии на микроорганизмы не вызывает повышения радиорезистентности. Однако по аналогии с общебиологической закономерностью в стимулирующем действии различных вредных веществ, например, малых доз ядов, возникает мысль о возможном стимулирующем действии малых доз ионизирующих излучений. Данные, полученные различными авторами, противоречивы, что в значительной мере зависит от использования малых дол различной величины от нескольких десятков до сотен и тысяч единиц излучения, от различной чувствительности к облучению разных физиологических процессов протекающих в клетке.