Материалы и методы

Объекты исследования — два сорта яровой пшеницы местной селекции (Казахстанская раннеспелая, Казахстанская 19) и Brachypodium distachyon (21 линия), семена которого были предоставлены Центром биоресурсов RIKEN BRC (Япония). Основанием для выбора сортов пшеницы являлась степень устойчивости или чувствительности к листовой ржавчине. По результатам оценок лаборатории иммунитета и защиты растений КазНИИ земледелия и растениеводства и НИИ проблем биологической безопасности РК сорт Казахстанская 19 проявляет устойчивость к бурой (14%) и желтой ржавчинам, тогда как сорт Казахстанская раннеспелая поражается бурой ржавчиной до 40%. Оба сорта отвечают требованиям ГОСТа. В фазе роста двух листьев, растения опытного варианта подвергали инокуляции урединиоспорами, контролем служили необработанные растения. Инокулят — казахстанская популяция спор гриба Puccinia recondita предоставлена Научноисследовательским институтом проблем биологической безопасности страны. Симптомы заражения у растений регистрировали на 7-е сутки. Они проявлялись на верхней стороне листьев, реже на листовых влагалищах в виде бурых пустул (урединий) диаметром 0,5−2,0 мм.

Определение активностей ксантиндегидрогеназы и альдегидоксидазы проводили методом нативного гель-электрофореза. Листья экстрагировали (в соотношении 1:4) экстракционным буфером, содержавшим в себе 250 мМ Трис-НСl (рН = 8,48), 1 мМ ЭДТА, 14 мМ L-глутатион, 4 мМ дитиотрейтол, 5 мМ L-цистеин, 0,05 мМ раствор Na2MoO4*2H2O, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 0,001 мМ пепстатин и 250 мМ раствор сахарозы. Экстракты центрифугировали при 14 000 оборотах в минуту при 40C в течение 20 минут. Супернатанты полученные из листьев, сначала прогревали при 600C в течение 2 минут и только после повторного центрифугирования в течение 5 минут при тех же условиях в охлаждаемой центрифуге использовали для анализа. Активность ферментов определяли в 7,5% полиакриламидном геле после фракционирования белков методом нативного гельэлектрофореза по стандартной методике (Laemmli, 1970). По завершении электрофореза полученные гели снимали со стекол и обрабатывали реакционной смесью, содержащей 50 мМ трис-НСl (рН=8,48), 3,4 мМ 3(4,5-диметилтиазолил-2)2,5- дифенилтетразолий бромид и 0,1 мМ феназинметосульфат. В качестве субстрата для ксантиндегидрогеназы служили 1,5 мМ гипоксантин и 0,5 мМ ксантин, в качестве субстрата для альдегидоксидазы — 2,5 мМ ванилин, 0,5 мМ индол-3-альдегид. Для визуализации активности ферментов гели в течение 20−30 минут инкубировали в указанной выше смеси в темноте на качалке при температуре 370C. Активности ферментов ксантиндегидрогеназы и альдегидоксидазы оценивали по относительной интенсивности окрашивания формазановых полос с помощью обработки программой ImageJ цифровых изображений гелей, полученных на сканере Epson Perfection V750 PRO.