Результаты исследований. 
Получение компонентов нутталийного диагностикума

Разработанная нами схема технологического процесса получения сухой гаммаглобулиновой фракции к нутталийному антигену выглядит следующим образом:

Первая стадия. Получение корпускулярного нутталийного антигена из крови лошадей и ослов, экспериментальным путем зараженных нутталиями и спленэктомированных с целью усиления паразитемии.

Вторая стадия. Получение гипериммунных сывороток крови к нутталийному антигену путем иммунизации лабораторных животных нутталийным антигеном.

Третья стадия. Выделение гамма-глобулиновой фракции из гипериммунной сыворотки крови путем высаливания, ее концентрация.

Четвертая стадия. Составление серии нутталийного гамма-глобулина, расфасовка и этикетирование ампул.

Пятая стадия. Упаковка, маркировка и хранение гамма-глобулина.

Гипериммунные сыворотки крови получали иммунизацией кроликов (массой не менее 2,5кг) нутталийным антигеном по модифицированной нами методике. Иммунизацию кроликов проводили антигеном в дозе 1,5 мг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в соотношении 1:1 в подушечки четырех лапок по 0,25 см³ в каждую. Через 21 день кроликов реиммунизировали той же дозой антигена с ПАФ в бедренные мышцы обеих лапок по 0,5 см³ смеси в каждую.

Начиная с 7-го дня после второй иммунизации вели ежедневный контроль за титром преципитирующих антител реакцией количественной преципитации (РКП) или иммуноферментным анализом (ИФА). При достижении титра преципитирующих антител не ниже 1 мг/мл в РКП или 1:25 000 в ИФА от кроликов брали кровь из краевой ушной вены спирт-ксилольным методом по 40 мл трехкратно, с интервалом в 72 ч.

При низких титрах антител (менее 1 мг/мл в РКП и ниже 1:25 000 в ИФА) проводили дополнительную иммунизацию. Через 15 дней после реиммунизации проводили цикл внутривенных инъекций. Антиген в дозе 1,5 мг на кролика вводили двукратно с интервалом в 24 ч в центральную ушную вену. Во избежании аллергической реакции за 2 ч. до внутривенного введения кроликов сенсибилизировали малыми дозами антигена (25 мкг). Контроль за титром антител осуществляли в РКП или в ИФА. Собирали сыворотки отдельно от каждого иммунизированного кролика.

Затем из гипериммунной сыворотки крови путем высаливания сульфатом аммония (50%) выделяли гамма-глобулиновую фракцию по общепринятой методике. Выделенный гамма-глобулин растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды и обессоливали на колонке с сефадексом G-50 или диализом против проточной воды (12 ч.), дистиллированной воды (24 ч) и физиологического раствора (24 ч).

После обессоливания гамма-глобулин концентрировали в диализных трубках на полиэтиленгликоле (ПЭГ) -600 до содержания белка 10 мг/мл.

Каждую серию гамма-глобулина одновременно расфасовывали в ампулы по 2 см³ с содержанием белка 10 мг/ см3. Подвергали лиофильной сушке и запаивали под вакуумом. Ампулы этикетировали с указанием: наименования препарата, количества доз, даты изготовления, срока годности, номера серии.

Нутталийный гамма-глобулин представляет собой лиофилизированную гаммаглобулиновую фракцию, выделенную из гипериммунной сыворотки крови кроликов к нутталийному антигену и предназначен для использования при постановке иммуноферментного анализа для прижизненной диагностики нутталиоза однокопытных. Хранится в темном сухом помещении при температуре 2−10 С до 18 месяцев.

Полученный нутталийный гамма-глобулин испытывали в антиген выявляющем варианте ИФА с сыворотками крови спонтанно и экспериментально зараженных нутталиозом животных по методу A. Voller (1976), коньюгацию кроличьего JgG с пероксидазой и хрена Олайнского производства с показателем чистоты 2,7−3,2 производили по методу P.K.Nagane et all (1974).

Готовили карбонатно-солевой буферный раствор (рН 9,6) (КСБ) следующим образом: 0,1 М растворы натрия углекислого и натрия двууглекислого на физиологическом растворе, затем к натрию углекислому приливали натрий двууглекислый до рН 9,6.

Приготовление фосфатно-солевого буферного раствора (рН 7,2−7,4) содержащего 0,05% твин -80 (ФСБ-Т) проводили следующим образом: 0,01 М раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного приливали к двузамещенному натрию фосфорнокислому до рН 7,2−7,4. К фосфатно-солевому буферному раствору добавляли твин -80 из расчета 0,5 см³ на 1000 см³ буфера (0,05%).

Субстратно-индикаторную смесь готовили следующим образом: 70 мг 5- аминосалициловой кислоты растворяли в 100 см³ дистиллированной воды при 70 оС, доводили рН до 6,0 0,1 М КОН и добавляли 0,16 см³ 3%-ного раствора перекиси водорода.

Исследуемые сыворотки крови разводили КСБ 1:25.

Содержимое ампул с нутталийным гамма-глобулином растворяли 1:5000 в ФСБ-Т.

Разведение антител диагностических против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой (конъюгат) готовили согласно наставления по применению.

В лунки полистироловых иммунологических планшет вносили по 0,2 см³ раствора исследуемых сывороток крови, закрывали крышкой и инкубировали 18 ч при 4 0С или 3 ч при 37 0С. Затем планшеты промывали ФСБ-Т трижды и в лунки вносили раствор гаммаглобулина до 0,2 см³. Инкубировали 1 ч при 37 0С и промывали ФСБ-Т трижды, после чего в лунки вносили раствор антивидового кроличьего конъюгата по 0,2 см³. Инкубировали 1 ч при 37 0С и четыре-пять раз отмывали ФСБ-Т. Затем в лунки планшет вносили по 0,2 см³ субстратно-индикаторной смеси.

Останавливали реакцию через 20−40 мин добавлением в каждую лунку 0,05 см³ серной кислоты, приготовленной путем растворения 2 см³ концентрированной серной кислоты в 10 см³ дистиллированной воды.

Учет результатов реакции проводили визуально.

При наличии специфических нутталийных антигенов субстрат окрашивается в темно-коричневой дает. Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраски или имеющие слабое пожелтение.

Приготовленный нами гамма-глобулин к нутталийному антигену испытывался на чувствительность с заведомо позитивными нутталийными и заведомо отрицательными сыворотками в антигенвыявляющем варианте ИФА.

Результаты изучения чувствительности антиген выявляющего варианта ИФА при нутталиозе лошадей, где в качестве стандартного реагента использован приготовленный нами нутталийный гамма-глобулин приведены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что наивысший титр регистрировался при разведениях позитивной сыворотки в соотношении 1:640. Реакция была положительной в случае исследования позитивных нутталийных сывороток и отрицательной при исследовании негативной сыворотки здоровых животных, что показывает на объективность теста и возможности использования нутталийного гамма-глобулина в ИФА для прижизненной диагностики нутталиоза однокопытных.