Материалы и методы

По программе вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) было обследовано 10 супружеских пар, которые имели показания к проведению ПГС методом aCGH. Средний возраст женщин составил 34,4±5,2 года (от 26 до 42 лет). Программу ЭКО/ИКСИ проводили по стандартному протоколу. Дополнительными критериями включения пациентов в исследование являлось носительство однонуклеотидных мутаций в генах системы свертывания крови (фактор Ляйдена — F5, метионин-синтаза — MTR, метилентетрагидрофолатредуктаза — MTHFR, метионин-синтаза редуктаза — MTRR), а также высокая совместимость супругов по генам HLA (наличие трех и более совпадений по аллелям генов HLA II класса — DQA, DQB и DRB1).

В результате трансвагинальных пункций фолликулов было получено 85 ооцитов с индивидуальными колебаниями от 4 до 15 (в среднем 8,5 ооцитов на пациентку), среди которых доля ооцитов в стадии метафазы второго деления мейоза (категория МII) составила 76 (89,4%). После выполнения ИКСИ коэффициент нормального оплодотворения составил 90,5%, т. е. всего оплодотворилось 77 ооцитов (по 7,7 на пациентку).

При оценке качества эмбрионов пригодными к биопсии бластомера было признано 35 зигот (класс А), что составило 45,5% от нормально оплодотворенных зигот. Биопсия бластомеров выполнялась на 3-й день культивирования при достижении эмбрионами 6−8 клеточной стадии. В блестящей оболочке эмбриона инфракрасным лазером формировали отверстие при помощи системы лазерной диссекции «Zilos-tk» (Hamilton Thorne, USA). Далее осуществляли захват бластомера пипеткой, который шестикратно отмывали в специальной среде PBS-PVP (1% поливинилпирролидон в фосфатно-солевом буфере) и затем переносили в 0,2 мл пробирку с реагентом для экстракции ДНК. Пробирки центрифугировали и переносили в холодовой штатив для дальнейших манипуляций.

В настоящем исследовании ПГА генетического материала бластомера проводили с использованием набора «PicoPLEX™ WGA Kit» (Rubicon Genomics, США) на ДНК-амплификаторе «Veriti» (Thermo Fisher Scientific, USA) согласно стандартному протоколу производителя. Контроль качества продуктов ПГА оценивали по результатам электрофореза в 1,5% агарозном геле с помощью системы «ChemiDoc™ XRS+» (Biorad, США). Для последующего исследования отбирались образцы демонстрирующие хорошо различимые, яркие полосы со средним размером амплифицированных фрагментов 400 п. н.

HLA-генотипирование проводили на мультиплексном проточном анализаторе «Luminex-200» (Luminex Corporation, США). В работе использовали наборы реагентов «Lifecodes HLA-DQA/B SSO Typing Kit», «Lifecodes HLA-DRB1 SSO Typing Kit» (Immucor, США). Постановку реакции и анализ результатов проводили согласно стандартному протоколу производителя.

Для исследования однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) использовали времяпролетный масс-спектрометр MALDI-TOF «Autoflex speed T» (Bruker, Германия) и набор реагентов «SNP-экспресс-MS» (Литех, Россия) к следующим SNP: фактор Ляйдена (F5, G1691A R506Q G>A, rs6025) метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR, A223V C677T C>T, rs1801133); метионин-синтаза (MTR, D919G 2756 A>G, rs1805087); метионин-синтаза редуктаза (МTRR, I22M A66G A>G, rs1801394). Все этапы реакции минисеквенирования выполняли согласно протоколу производителя. Продукты минисеквенирования в объеме 0,4 мкл, наносили на мишень («AnchorChip»), предварительно покрытую матрицей на основе 3-гидроксипиколиновой кислоты. После высушивания мишени с нанесенными образцами ее помещали в масс-спектрометр для регистрации и обработки масс-спектров при помощи стандартного пакета программ «FlexControl», «FlexAnalysis» и «Genotools» .