Методы исследований. 
Разработка состава и технологии мази с эфирным маслом иссопа для лечения простудных заболеваний

При выполнении работы были использованы современные технологические, физико-химические, структурно-механические, биофармацевтические и биологические методы исследования, позволяющие оценивать образцы исходных веществ и готовых лекарственных форм [177, 178, 179, 180, 181].

Для проведения контроля качества образцов изучаемых лекарственных форм придерживались рекомендаций и методик, приведенных в ГФУ 1 изд., Раздел «Мягкие лекарственные средства для местного применения», с. 507−511. Для некоторых мазей дополнительно пользовались некоторыми методиками, приведенными в ГОСТ 29 189–91 «Кремы косметические. Общие технические условия».

Описание

Контролировали внешний вид и характерные органолептические свойства образцов (цвет, запах, консистенцию и т. д.). Исследуемые лекарственные формы контролировали на предмет наличия прогорклого запаха, а также признаков физической нестабильности (агрегация частиц, коалесценция, коагуляция, расслоение).

Определение однородности

Определение проводили по методике, приведенной в ГФУ 1 изд. С. 511. Принимали четыре пробы каждого образца по 20−30 мг каждая, размещали по две пробы на предметное стекло, накрывали вторым предметным стеклом и крепко прижимали до образования пятен диаметром около 2 см.

Полученные пробы рассматривали невооруженным глазом (на расстоянии около 30 см от глаз). Образец считали однородным, если во всех четырех пробах не выявлялись видимые частицы, инородные включения и признаки физической нестабильности: агрегация и коалесценция частиц, коагуляция. Если одна из проб не выдерживала испытания, определение проводили дополнительно еще на восьми пробах, при этом все восемь проб имели выдерживать тест.

Определение коллоидной стабильности

Для проведения теста использовали лабораторную центрифугу с набором пробирок, ртутный термометр с интервалом измеряемых температур от 0 до 100 °C и ценой деления 1 °C, а также секундомер и водяную баню.

Пробирки наполняли на 2/3 объема (примерно 9 г) исследуемыми образцами (так, чтобы массы пробирок с препаратом не отличались более чем на 0,02 г), и взвешивали с точностью до 0,01 г. Затем пробирки содержали в водяную баню при температуре (42,5 ± 2,5) °С на 20 минут, после чего насухо вытирали с внешней стороны и размещали в гнезда центрифуги. Центрифугировали в течение 5 минут со скоростью 6000 об/мин (относительная сила центрифугирования при этом составляла около 5000 g).

Образец считали стабильным, если после центрифугирования в пробирках не наблюдали расслоение. Если хотя бы в одной из пробирок наблюдали расслоение образца или выделение осадка, анализ проводили повторно с новыми порциями. Если при повторном тесте выявляли хотя бы одну пробирку с расслоением, образец считали нестабильным.

Определение термостабильности

Для определения брали 5−6 стеклянных пробирок диаметром 15 мм и высотой 150 мм. Пробирки наполняли 8−10 мл исследуемыми образцами и помещали их в термостат марки ТС-80М-2 с температурой (42,5 ± 2,5) °С на 7 суток. После этого образцы переносили на 7 суток в холодильник с температурой (6 ± 2) °С и затем в течение 3 суток выдерживали их при комнатной температуре. Стабильность определяли визуально: если в одной пробирке не наблюдали расслоение, то образец считали стабильным.

Определение рН

Уровень рН исследуемых образцов определяли потенциометрически (ГФУ 1 изд., 2.2.3). Тест проводили 5−6 раз с новыми порциями исследуемых образцов.

Реологические исследования

Реологические исследования проводили с помощью прибора «Rheotest-2» (Германия), который представляет собой ротационный вискозиметр с коаксиальными цилиндрами. Он используется для определения динамической вязкости ньютоновских жидкостей и для проведения широкого круга реологических исследований неньютонивских жидкостей. Для последних записывалась реограма — кривая текучести, отражающий зависимость касательной напряжения сдвига (фr) от градиента скорости сдвига (Dr). Исходя из вида кривой текучести, определяли тип течения системы, структурную вязкость (з), экстраполированное предельное напряжение сдвига, наличие тиксотропных свойств и т. п.

Измерения проводили при комнатной температуре и (34,0±0,2) єС (температура кожи) кроме отдельных случаев, указанных ниже. Температуру измеряли лабораторным термометром с ценой деления 0,1 єС. Термостатирование осуществляли с помощью ультратермостата, входящего в комплект реотеста.

Для исследования брали навеску экспериментального образца (около 30 г) и помещали в емкость внешнего неподвижного цилиндра, после чего цилиндр крепили к станине прибора, помещали в него внутренний подвижный цилиндр. В результате исследуемая основа заполняла кольцевую щель коаксиальных цилиндров. При определенных скоростях вращения внутреннего цилиндра фиксировали показатели индикатора прибора. Показатели вискозиметра фиксировали на каждой ступени скорости, после выдержки в течение 15 секунд. Определение проводили при увеличении скорости вращения цилиндра и обратно. На максимальной скорости вращения систему выдерживали 1 минуту с последующей фиксацией напряжения сдвига.

Касательное напряжение сдвига вычисляли по формуле 2.1:

гдефr — касательная напряжение сдвига, Па Мс;

z — константа прибора (зависит от типа цилиндра);

а — показания прибора.

После вычисления напряжения сдвига при определенных скоростях сдвига, рассчитывали структурную вязкость исследуемых основ, пользуясь формулой 2.2:

где Dr — скорость сдвига, с-1;

з — структурная вязкость, ПаМс;

Реологические (структурно-механические) свойства образцов определяли также с помощью ротационного вискозиметра «Rheolab QC» (Anton Paar, Австрия) с коаксиальными цилиндрами C-CC27/SS. Прибор позволяет измерять касательное напряжение смещения (ф) в интервале 0,01−3,0· 10⁴ Па, градиент скорости сдвига (Dr с^-1) от 0,1 до 4000 с^-1, вязкость (з) — 0,01−106 Па· с. Данный прибор «Rheolab QC» позволяет осуществлять статистическую обработку полученных данных. Из многочисленного количества моделей математической обработки полученных результатов эксперимента выбрана модель Casson I. Данная модель является наиболее известной реологической моделью описания неньютоновских жидкостей.

Изучение реологических параметров осуществляли при температуре от 20 єС до 34 єС. Термостатирование образцов осуществляли с помощью термостата MLM U15c.

Навеску образца около 17,0 (± 0,5) г помещали в емкость внешнего неподвижного цилиндра, устанавливали необходимую температуру опыта, время термостатирования — 30 мин. С помощью программного обеспечения, которым оснащен прибор, устанавливались условия опыта: (градиент скорости сдвига внутреннего цилиндра (от 3,42 до 150 с^-1), количество замеряемых точек на кривой течения образца (45), продолжительность измерения каждой точки кривой (1 с.).

Определение количественной оценки течения мазей. Проводят при помощи ротационного вискозиметра «Реотест-2» с цилиндрическим устройством путем определения вязкости системы при скоростях сдвига 3,0 и 5,4 с^-1, соответствующих скорости движения ладони при распределении мягкой лекарственной формы по поверхности слизистых оболочек и вязкости системы при скоростях сдвига 27,0 и 145,8 с^-1, воспроизводящих скорость технологической обработки в процессе ее изготовления. На основании полученных результатов рассчитывают по формулам величины коэффициентов динамического течения системы.

(2.3).

(2.4).

где K_d1, K_d1 — коэффициенты динамического течения;

з — эффективная вязкость при определенных скоростях сдвига.

Определение плотности.

Плотность эфирного масла определяли согласно ГФУ, 1-е изд., (2.2.6).

Чистый сухой пикнометр взвешивают с точностью до 0,0002 г, заполняют с помощью маленькой воронки дистиллированной водой немного выше метки, закрывают пробкой и выдерживают в течение 20 мин в термостате, в котором поддерживают постоянную температуру воды 20 єС. При этой температуре уровень воды в пикнометре доводят до метки, быстро отбирая излишек воды при помощи пипетки или свернутой в трубку полоски фильтровальной бумаги. Пикнометр снова закрывают пробкой и выдерживают в термостате еще 10 мин, проверяя положение мениска по отношению к метке, затем пикнометр вынимают из термостата, фильтровальной бумагой вытирают внутреннюю поверхность горлышка пикнометра, а также весь пикнометр снаружи, оставляют под стеклом аналитических весов в течение 10 мин и взвешивают с той же точностью.

Пикнометр освобождают от воды, высушивают, споласкивая последовательно спиртом и эфиром (сушить пикнометр путем нагревания не допускается), удаляют остатки эфира продуванием воздуха, заполняют пикнометр испытуемой жидкостью и затем производят те же операции, что и с очищенной водой.

Плотность (р₂₀), г/см³ вычисляют по формуле:

.

где, m — масса пустого пикнометра, г;

m₁ — масса пикнометра с очищенной водой, г;

m₂ — масса пикнометра с испытуемой жидкостью, г;

• 0,99 703 — значение плотности воды при 20 єС, г/см³ (с учетом плотности воздуха);
• 0,0012 — плотность воздуха при 20 єС и барометрическом давлении 760 мм рт. ст.

Определение кислотного числа.

Кислотным числом называют количество миллиграммов едкого кали, необходимое для нейтрализации свободных кислот, содержащихся в 1 г исследуемого вещества [177].

Около 10 г (точная навеска) масла, жира, воска или около 1 г (точная навеска) смолы помещают в колбу вместимостью 250 мл и растворяют в 50 мл смеси равных объемов 95% спирта и эфира, предварительно нейтрализованной по фенолфталеину раствором едкого натра (0,1 моль/л); если необходимо, нагревают с обратным холодильником на водяной бане до полного растворения. Прибавляют 1 мл раствора фенолфталеина и титруют при постоянном помешивании раствором едкого натра (0,1моль/л) до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. для вещества с небольшим кислотным числом (до 1) титрование проводят из микробюретки.

Кислотное число (кч) вычисляют по формуле:

.

где, а — количество миллилитров раствора едкого натра (0,1 моль/л), израсходованное на титрование;

б — навеска вещества, г;

5,61 — количество миллиграммов едкого кали, соответствующее 1 мл раствора едкого натра (0,1 моль/л).

Определение эфирного числа Эфирное число, обозначающее количество миллиграммов едкого кали, пошедшее на омыление сложных эфиров, содержащихся в 1 г эфирного масла, определяют в растворе, полученном после определения кислотного числа [177]. К этому раствору прибавляют 20 мл спиртового раствора едкого кали (0,5 моль/л) и нагревают на водяной бане в колбе с воздушным холодильником (диаметр трубки 1 см, длина 100 см) в течение 1 часа, считая с момента закипания. затем раствор разбавляют 100 мл воды и избыток едкого кали титруют раствором серной кислоты (0,25 моль/л), (индикатор — фенолфталеин).

Эфирное число (х) вычисляют по формуле:

.

где, v — объем спиртового раствора едкого кали (0,5 моль/л), израсходованного на омыление эфиров, мл;

m — навеска масла, г;

28,05 — количество миллиграммов едкого кали, содержащихся в 1 мл спиртового раствора едкого кали (0,5 моль/л).

Определение эфирного числа после ацетилирования Эфирное число после ацетилирования обозначает количество миллиграммов едкого кали, необходимое для омыления суммы сложных эфиров, содержащихся первоначально в 1 г масла и образовавшихся при ацетилировании [177].

Определение проводят следующим образом: 10 г масла помещают в специальную колбу для ацетилирования с пришлифованным воздушным холодильником, приливают 10 мл уксусного ангидрида и прибавляют около 2 г безводного ацетата натрия. Смесь кипятят на песчаной бане в течение 2 ч. после охлаждения прибавляют 20 мл воды и нагревают на водяной бане при частом взбалтывании в течение 15 мин. затем смесь переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл и отделяют слой масла. Масло 4−5 раз промывают при взбалтывании 50 мл насыщенного раствора хлорида натрия, затем масло дважды промывают порциями воды по 20 мл для удаления следов хлорида натрия, обезвоживают безводным сульфатом натрия (около 3 г) и фильтруют 1−2 г полученного масла (с точностью до 0,001 г), взвешивают в конической колбе, растворяют в 5 мл спирта, нейтрализуют спиртовым раствором едкого кали (0,5 моль/л), (индикатор — фенолфталеин) и определяют эфирное число (как описано выше).

Эфирное число после ацетилирования (х2) вычисляют по формуле.

.

где, v — объем спиртового раствора едкого кали (0,5 моль/л), израсходованного на омыление эфиров, мл;

m — навеска масла, г;

28,05 — количество миллиграммов едкого кали, содержащихся в 1 мл спиртового раствора едкого кали (0,5 моль/л).

Определение показателя преломления (индекс рефракции) Определение проводили согласно ГФУ, 1-е изд., (2.2.6).

Количественное определение эфирного масла иссопа зеравшанского.

Количественное определение ЭМИЗ в мазях проводили спектрофотометрическим методом.

Предварительно готовятся стандартные спиртовые растворы эфирного масла.

Приготовление стандартного спиртового раствора

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещали точную навеску ЭМИЗ 0,01 г и доводили этанолом до метки (раствор А). Затем в пикнометр, вместимостью 10 мл, последовательно помещали от 0,5 до 3,5 мл раствора А, то есть готовили раствор Б, доводя его до метки этанолом. Полученные растворы тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 280 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

На основании проведённых исследований, за стандартный раствор ЭМИЗ взято количество раствора А, соответствующее 2,0 мл ЭМИЗ концентрацией 0,0034%, оптическая плотность которого равна 0,55.

Количественное определение эфирного масла в мази.

Точную навеску (около 0,5г) мази отвешивали в бюкс и растворяли в 10 мл этанола. Полученный раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл (бюкс смывали этанолом), раствор в колбе доводили до метки этанолом, перемешивали, 2 мл полученного раствора помещали в пикнометр вместимостью 10 мл и доводили этанолом до метки. Измеряли оптическую плотность мази с ЭМ на спектрофотометре при длине волны 280 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения использовали раствор чистой основы, приготовленный по аналогичной схеме.

Относительная ошибка определения не превышает 1,92%.

Спектрофотометрические исследования в инфракрасной области с использованием спектрофотометра ПЭ-5400УФ (Российская Федерация) проводили для идентификации спектров чистого ЭМ и ЭМ, извлечённых из свежеприготовленной мази и мази, находившейся на хранении. Извлечение ЭМ из мази осуществляли н-гексаном, т.к. основа мазей имеет свой собственный ИК-спектр и, кроме того, она гидрофобная, что затрудняет идентификацию спектров.

Жидкостная хроматография Исследования проводились согласно требованиям ГФУ, 1-е изд., дополнение 1, (2.2.29., N).

Эфирные масла, полученные методом дистилляции, высушивали безводным сульфатом натрия и запаивали в ампулы. Химический состав масла исследовали на газовом хроматографе Agilent Technologies (6890N) с квадрупольным массспектрометром (MSD 5973) в качестве детектора, на кварцевой колонке HP5MS (30 м х 0,25 мм).

В хроматограф вводили 1%-ный раствор масел в метаноле. Температура испарителя 280 єС. Начальная температура колонки 100 єС (1 мин.), далее 100−230 єС (2 єС/мин.), 230 єС (1 мин). Температура интерфейса между газовым хроматографом и массселективным детектором — 280 єС. Температура источников ионов — 173 єС. Энергия ионизирующих электронов — 70 эв. Данные собирались со скоростью 1,2 скан./с в диапазоне 30 650 а.е.м.

Микробиологические методы исследования

Оценка микробиологической чистоты Исследования микробиологической чистоты образцов мазей осуществляли согласно требованиям ГФУ, 1-е изд., (2.6.12., 2.6.13.).

Оценка антимикробной активности.

Антимикробную активность ЭМИЗ, как в отдельности, так и в составе мази, изучают методом серийных разведений и диффузии в агар.

Исследование методом диффузии в агар проводят следующим образом: в стерильные чашки Петри разливают мясопептонный агар, после застывания слоя на поверхность помещают цилиндры и вокруг заливают мясопептонный агар, засеянный культурой испытуемого микроба, после застывания вынимают цилиндры и в образовавшиеся лунки заполняют нужным количеством испытуемого масла или мази. Чашки помещают в термостат и инкубируют при 37 єС в течение 24−48 часов. Степень чувствительности микробов к препарату определяют по диаметру зоны задержки роста вокруг лунки.

Метод серийных разведений. Приготовляют 1% спиртовые растворы ЭМИЗ. Из каждого исследуемого вещества готовят ряд последовательно убывающих по концентрации растворов на жидкой питательной среде Хотингера, из расчёта 1 мл от 64 до 512 мкг препарата (5 пробирок), 6-я пробирка служит контролем засеваемой культуры. В каждую пробирку засевают свежую культуру одного из испытуемых микроорганизмов, выращенных на мясопептонном агаре. Во всех случаях микробная нагрузка одинаковая — 1000 микробных тел в 1 мл. Посевы инкубируют при температуре 36−37 єС. Параллельно изучают контроль (мясопептонный бульон без добавок масел, контроли со спиртом и др.).

Минимальное количество препарата, дающее полную видимую задержку роста культуры (прозрачный бульон) соответствует минимальному количеству масла и определяет степень чувствительности штаммов к ЭМ.

Для установления бактерицидного действия ЭМ на тест-культурах из прозрачных пробирок после осторожного взбалтывания жидкости производят посев на агаровые среды. Наименьшую концентрацию ЭМ в пробирке, посевы из которой при инкубации в течение 24−72 часов не дают рост на питательной среде, принимают за минимальную бактерицидную концентрацию.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений Исследования проводились согласно требованиям ГФУ, 1-е изд., дополнение 1, (5.3).

ВЫВОДЫ

• 1. Теоретически обоснована методология создания мягких лекарственных средств для лечения дерматомикозов, осложненных гиперкератозом с учетом медико-биологических требований.
• 2. Представлены краткие данные об активных фармацевтических ингредиентах и вспомогательных веществах, которые использовали при розработке и исследовании мягких лекарственных форм.

Предложены методики фармакотехнологических, физико-химических, структурно-мехнических, микробиологических и фармакологических исследований мягких лекарственных средств, которые позволяют объективно оценить их технологическое качество.