Анализ микроделеций у хромосомы в AZF локусе у мужчин с идиопатическим бесплодием

В настоящее время бесплодием страдают около 10−15% супружеских пар, при этом примерно в 50% случаев оно обусловлено нарушением репродуктивной функции со стороны мужчины, в 20% - нарушением репродуктивной функции обоих супругов [1,2]. Кроме того, бесплодие у мужчин в 40−50% случаев может быть связано с нарушениями количественных и/или качественных показателей эякулята [3,4]. Примерно у 31,7% мужчин причину бесплодия установить не удается (идиопатическое бесплодие) [5] и предполагается, что оно обусловлено генетическими или иммунологическими факторами.

Мутации генов, контролирующих этапы сперматогенеза, могут приводить к нарушению подвижности, морфологических и фертильных свойств сперматозоидов, блоку сперматогенеза, проявляясь в диапазоне от легкого снижения сперматогенной активности до полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах (синдром «только клетки Сертоли»). Так, микроделеции локуса AZF (Azoospermia Factor, фактор азооспермии) [6,7] хромосомы Y обнаруживаются в среднем в 10−15% случаев азооспермии и в 5−10% случаев олигозооспермии тяжелой степени [8,9], и обусловливают нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин. На коротком плече У-хромосомы расположены: детерминирующий пол человека ген SRY (sexdetermining region Y) и ген ZFY (zink finger protein Y) отвечает за формирование пола и оказывает частичное влияние на дифференцировку гонад, два гена позволяющие определить соответствие фенотипического пола генотипическому, а так же множество генов экспрессирующихся при сперматогенезе, такие как AZF регионы длинного плеча У-хромосомы [10,11].

В У хромосоме выделены три неперекрывающихся субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc. Гены — кандидаты AZFa-субрегиона представлены на У хромосоме единственной копией, поэтому, даже точковые мутации могут вызывать нарушения сперматогенеза и приводить к бесплодию мужчин. Тогда как гены, субрегионов AZFb и AZFc содержат по три десятка генов, многие из которых представлены в двух и более копиях [12,13]. Наиболее частым типом полных AZF делеций являются AZFc делеций, доля которых составляет 65−70% от всех полных AZF делеций. Второе место по частоте встречаемости 15−20% занимают делеции, захватывающие регионы AZFс иили AZFb (AZFb+с). Наиболее редко 5−10% выявляют делеции AZFa региона. В редких случаях обнаруживают другие типы AZF делеций, например, AZF a+b и AZF a+b+c. В большинстве случаев микроделеции являются мутациями de novo, но имеются сведения об единичных случаях наследования после экстракорпорального оплодотворения [14,15].

Целью исследования: кариологическое исследование лимфоцитов периферической крови и изучение AZF региона У хромосомы у мужчин с нарушением сперматогенеза.

Материалы и методы. Материалом исследования явилась периферическая кровь мужчин обратившихся в медико-генетическое консультирование с диагнозом мужское бесплодие, патозооспермия. Всем 104 пациентам по показаниям проводили цитогенетическое и молекулярно-генетические исследования.

Для проведения цитогенетических исследований использовали гепаринизированную, венозную кровь пациентов. Препараты хромосом получали из лимфоцитов периферической крови по стандартной методике: 1,5 мл сыворотки крупного рогатого скота, 6 млRPMI 1640 + стерильный L-глутамин, 0,15 мл фитогемагглютинина, 0,5 мл периферической крови, стерильный раствор 10 г колхицина, гипотонический раствор 2,79% KCL, охлажденный раствор фиксатораэтаноловый спирт100% ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1, 3% ледяная уксусная кислота. Препараты окрашивали GTG-методом. Результаты цитогенетического исследования приведены согласно Международной системе номенклатуры цитогенетики человека[16].

Для проведения молекулярно-генетических исследований из периферической крови была выделена геномная ДНК (набором «Promega», USA). Мультиплексную полимеразную цепную реакцию (мПЦР) проводили на программируемом термоциклере ТП4-ПЦР-01 (ДНК-технология), с использованием Taq-полимеразы. Состав ПЦР смеси: ПЦР буфер-5,0 мкл, dNTPs-12,5мкл, праймеры-1,0 мкл, Taq-полимераза-0,2 мкл, H2O-14,3 мкл, ДНК-2,0 мкл, контрольная ДНК-2,0 мкл. Общее количество смеси -25 мкл. Программа ПЦР проводилась в следующем режиме: 95°- 5 мин; 94°- 45 сек, 65°- 45 сек, 72°- 45 сек — 30 циклов; 72°-7 мин.

Результаты амплификации оценивали методом электрофореза в 7% полиакриламидном геле, с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия. Набор праймеров использованных на данном этапе, позволял исследовать 9 STS-маркеров, специфичных для AZF-локусов: 1) для субрегиона AZFa: sY86; sY84; sY615; 2) для субрегиона AZFb: sY127, sY134; 3) для субрегиона AZFc: sY254, sY255; 4) SRY;5) ZFY.

Результаты и обсуждение. Анализ спермограммы показал, что наиболее часто в 59% случае были диагностированы азооспермии, астенотератозооспермия и тератоспермии, олигоастенозоосперия — в 10%, и олигозооспермии — в 5% случаев.

Как видно из данных таблицы 1 при цитогенетическом исследовании лимфоцитов периферической крови нормальный кариотип — 46, ХУ был диагностирован у 85% (89) пациентов. Хромосомная патология была выявлена в 15% случаев (15) пациентов. Анализ хромосомной патологии показал, что среди аберраций превалируют числовые хромосомные нарушения, так в 14 случаях диагностирован синдром Клайнфельтера (47,ХХУ) и в одном случае структурные хромосомные аберрации — робертсоновская транслокация — 45, ХУ, der (14;15)(q10;q10). Следует отметить, у пациентов с хромосомными аномалиями изменения в 80% (12) измененных спермограмм составили азооспермия, у 20% пациентов (3) — астенотератозооспермия и олигозооспермия.

Молекулярно-генетические исследования микроделеции У хромосомы были проведены 50 (48%) мужчинам с патозооспермией и имеющих нормальный кариотип- 46, ХУ. Микроделеции Ухромосомы обнаружены у 7 пациентов, что составило 14%. Были выявлены делеции AZF локусов: AZF a- 14%, AZF b- 14%, AZF а+b- 14%, AZF с-44%. В одном случае обнаружена делеция ZFY гена, которая не ассоциирована с нарушением сперматогенеза, используется в качестве маркера короткого плеча У хромосомы.

По результатам наших исследований видно, что у мужчин с показаниями «азооспермия и тяжелая олигозооспермия» наиболее часто встречалась микроделеция AZF ссубрегиона в 44%, и с одинаковой частотой равной 14% встречались микроделеций AZF a, AZF b, AZF а+b.

сперматогенез ген мужчина хромосома Таблица 1.

Цитогенетические и молекулярно-генетические показатели у мужчин с нарушением сперматогенеза.

Так, по данным литературы, для пациентов при обнаружении делеции локуса AZFс в У хромосоме у 71% пациентов могут быть извлечены зрелые сперматозоиды, c помощью ИКСИ в сочетании с извлечением тестикулярных сперматозоидов, в то время как у пациентов с мутацией в локусах AZFa, AZFb прогноз оплодотворения яйцеклетки неблагоприятный [15].

Таким образом, учитывая высокую частоту хромосомной патологии у пациентов с бесплодием неясного генеза, которым рекомендовано экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) или ИКСИ, необходимо проводить комплексное обследование, с обязательным цитогенетическим исследованием лимфоцитов периферической крови и молекулярно-генетический скрининг локусов AZF У хромосомы.

• 1. Vogt P.H., et al. Human chromosome Y azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yql1. Hum Mol Genet 1996; 5:933−943.
• 2. Hargreave T.B., et al., Chromosome Y microdeletions and male subfertility. Androl 1996;28: Suppl:19−21.
• 3. Pryor I.L., et al., Microdeletions in the Y chromosome of infertilemen. New Eng J Med 1997;336:534−53.
• 4. Черных В. Б. AZF делеции — частая генетическая причина бесплодия у мужчин: современное состояние исследований //Проблемы репродукции. № 1. 2009. С. 10−14.
• 5. Вартанян Э. В., Петрин А. Н., Курносов Т. Р. Генетические факторы мужского бесплодии //Проблемы репродукции. № 2. 2010. С. 74−78.
• 6. Федорова И. Д., Кузнецова Т. В. Генетические факторы мужского бесплодия. //Журнал акушерства и женских болезней. № 1. 2007. С. 64−72.
• 7. Foresta C., et al., Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis // Endocr. Rev. 2001. V. 22. P. 226−239.
• 8. Черных В. Б, Курило Л. Ф, Шилейко Л. и др. Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с бесплодием: совместный опыт исследований. // Медицинская генетика. № 8. 2003. С. 367−379.
• 9. Глинкина Ж. И., Кузьмичев Л. Н., Бахарев Л. Н. Профилактика наследования мутаций в AZF-локусе хромосомы Y у потомства мужчин с нарушением репродуктивной функции // Акушерство и гинекология.-№ 1.-2009. С. 52−55.
• 10. Черных В. Б. Макрои микроструктурные перестройки Y хромосомы //Медицинскаягенетика. № 10. 2007. С. 45−52.
• 11. Гоголевский П. А., Гоголевская И. К., Крамеров Д. А. и др. AZF-микроделеции и мужское бесплодие. // Андрология и генитальная хирургия. № 4. 2001. С. 73−78.
• 12. Тарасова М. Н., и др., К диагностике нарушений репродуктивной функции мужчин //Проблемы репродукции. № 5, 2008. С. 52−55.
• 13. Ahmadi A., Ng S.C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J Exp Zool 1999;284:696—704.
• 14. Долгов В. В., Луговская С. А., Фанченко Н. Д. и др. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. М 2006;145.
• 15. ISCN 2009. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature / Ed. Mitelman F. Basel: S. Karger. 2009. 138 p.