Генетические механизмы формирования и диагностики хронического бронхита у детей

ВСТУПЛЕНИЕ

В связи со значительной распространённостью хронических неспецифических заболеваний лёгких (ХНЗЛ) и высоким уровнем инвалидности, одной из важнейших задач здравоохранения является профилактика и эффективная диагностика и лечение детей с хроническим бронхитом (ХБ).

Генетические механизмы формирования острых и хронических болезней органов дыхания в последние годы стали объектом широкомасштабных исследований во всем мире.

Неотъемлемой частью профилактических программ сегодня является генетический скрининг. Проведение молекулярно-генетического исследования позволяет снизить уровень заболеваемости хБ у детей путём выявления предрасположенности к его развитию. В тоже время выявление генного полиморфизма с проявлением ХБ у детей может способствовать решению задач формирования групп риска и осуществлению среди указанных групп превентивных мероприятий, а также лучшему пониманию патогенеза данного состояния. В связи с этим весьма актуальным является вопрос о том, каков количественный вклад генетических механизмов в развитие ведущих симптомов ХБ у детей.

Результаты проведённого полногеномного анализа сцепления при хронических болезнях органов дыхания показали высокую степень сцепления локусов на хромосоме 19q — TFG-beta1(transforming growth factor beta 1, трансформирующий фактор роста бета1) и хромосоме 2q — SERPINE2 (serpin peptidase inhibitor, clade E, серпиновый ингибитор пептидаз тип Е) [1]. При полногеномных исследованиях генетических ассоциаций (GWAS) выявлено несколько локусов, связанных с развитием хронических болезней органов дыхания: на 4-й и 15-й хромосомах в области 15q25.1 — CHRNA3, CHRNA5 (cholinergic receptor nicotinic alpha 3 and 5, холинергические никотиновые рецепторы альфа-3 и -5), IREB2 (iron-responsive element binding protein 2, белок железосвязывающего элемента 2), PSMA4 (proteasome subunit alpha type 4, субъединица альфа-4-го типа протеосомного комплекса), 4q31.21 — HHIP (hedgehog interacting protein, взаимодействующий протеин hedgehog сигнального пути), 4q22. I — F AMI ЗА (family with sequence similarity 13 member A, член, А семейства со схожей последовательностью 13) и новый маркер rs7937 на хромосоме 19qL3 [2].

До «эры GWAS» генетическая составляющая хронических обструктивных болезней лёгких достаточно активно изучалась с использованием анализа генов-кандидатов [3, 4]. Данный метод до сих пор наиболее широко используется при проведении исследований по генетике хронических болезней лёгких, поскольку позволяет сосредоточиться на одном или нескольких функционально значимых аллельных вариантах гена, кодирующих соответственно варианты белка, различающиеся по структуре и функциям, некоторые из которых могут быть вовлечены в развитие патогенетических изменений.

Однако несмотря на значительное число исследований, выполненных с использованием разных подходов, молекулярно-генетические основы хронических болезней органов дыхания до сих пор остаются во многом не ясными.

На сегодняшний день перспективным является изучение не только генетических и молекулярных, но и эпигенетических факторов, таких, как метилирование ключевых генов, анализ активности гистонов, роли микро-РНК и т. д. Работа в различных направлениях позволит приблизиться к пониманию сложных процессов, приводящих к развитию болезни.

Резюмируя, можно констатировать, что недостаточная диспансерная работа и низкий уровень выявляемости того или иного лёгочного заболевания приводят к тому, что детей лечат с другими диагнозами, неадекватно. В результате, большинство детей поступает с запущенным патологическим процессом, который уже практически мало поддаётся консервативной терапии и требует хирургических вмешательств, например бронхоэктатическая болезнь. Наиболее значимыми является разработка новых методологических подходов к ранней диагностики, лечению и профилактике ХНЗл у детей.

Известно, что наверно наибольшая роль в процессе деструкции альвеолярной матрицы принадлежит провоспалительным клеточным протеиназам [5]. Протеолитические ферменты являются основными регуляторами воспалительных и иммунных реакций, связанных не только с деградацией белков экстрацелюлярного матрикса и высвобождение связанных интерлейкинов, но и расщеплением цитокинов и хемокинов, и, как следствие модуляции биологической активности медиаторов воспаления. Среди них — матричные металопротеиназы (MMPs, Matrix Metalloproteinases) — семейство из 26 ферментов неотъемлемая часть процессов развития, тканевого ремоделирования и восстановления. Патологическая экспрессия MMP ассоциируется с многими деструктивными процессами, включая пролиферацию опухолевой ткани, артриты, артериальные аневризмы и легочная эмфизема [5].

Целью исследования было изучить полиморфизм гена матричных протеиназ среди детей с хроническим бронхитом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследование были включены образцы ДНК 30 больных детей с хроническим бронхитом и 100 здоровых детей группы контроля.

Материалом для молекулярно-генетического исследования мутаций служила геномная ДНК, которая хранилась при температуре -20 °С. Мутации определялись методом полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием праймеров и зондов. В работе использовано ниже перечисленное оборудование:

• 1. GeneAmp® ПЦР — амплификатор Applied Biosystems 9700.
• 2. Генетический анализатор ABI PRIZM 310.
• 3. Дозаторы pipetman.
• 4. Центрифуга Eppendorf 5417С.
• 5. Вортекс Genie Scientific Industries, INC.
• 6. Аппарат для проведения горизонтального электрофореза (Helicon, Россия).
• 7. Гель-документирующая система «WiseDoc WGD- 30"(DAIHAN, Корея).
• 8. Термостат (Bio-Rad, Китай).

Выделение ДНК. Материалом для ДНК служила венозная кровь из локтевой вены объёмом 1 мл. Для сбора, хранения и транспортировки крови использовались одноразовые пластиковые пробирки объёмом 2,5 мл с антикоагулянтом (консерватором) объёмом 0,5 мл. Кровь для дальнейшей обработки хранилась при температуре не менее +4 °С.

Выделение ДНК из цельной крови осуществлялось набором реагентов Diatom™DNA Prep200 по стандартному протоколу (производство ООО «Лаборатория ИзоГен», Москва). Данный набор реагентов основан на использовании лизирующего реагента с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дербиса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS™ — сорбенте. ДНК, элюированная из сорбента ЭкстраГеном Е™, напрямую использовалась для дальнейшего проведения анализа.

Расчет рабочих концентраций праймеров

Поставка ПЦрпраймеров производителем осуществляется в количествах, измеряющихся в оптических единицах (ОЕ) в лиофилизированном виде. Для расчёта рабочих концентраций праймеров ОЕ перевели в мкмоль. Определяли концентрацию праймера, исходя из того, что 1 ОЕ олигонуклеотида соответствует концентрации 33 мкг/мл.

Для праймера, имеющего длину n пар нуклеотидов (п.н.), поставляемого в количестве (ОЕ), пересчет осуществлялся по этой формуле:

X=MW/10/(ОЕ)x33;

Приготовление рабочего раствора праймеров

Рабочий раствор (10 мкмоль) праймеров из лиофильного стока-праймера приготавливали по следующему расчёту:

50 мкл сток + 450 мкл ddH₂0.

Постановка ПЦР для амплификации генов

ПЦР проводили с помощью набора PCR Core.

Dilent — 10 ці.

Праймер — F1 — 2,5 ці.

Праймер — R4 — 2,5 ці.

ДНК — 5 ці.

ДНК выделяли из 1 мл венозной крови методом нуклеосорбции и анализировали методами агарозного гель-электрофореза, концентрации ДНК проверяли спектрофотометрически по отношению поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм (260 нм/280 нм), среднее отношение значений 260 нм/280 нм было равно 1.6−1.8.

Аллельные варианты полиморфных генов подвергались классическому молекулярно-эпидемиологическому анализу — сопоставлению встречаемости аллелей и генотипов у больных хроническим бронхитом и контролей. Тест на соответствие контрольной выборки равновесию Харди — Вайнберга проводили с использованием метода Х2 (а = 0,05, df = 1). Для выявления ассоциации между заболеванием и генотипом использовались мультипликативная и аддитивная модели наследования.

Ассоциацию между заболеванием и генотипом определяли с помощью критерия х2 (c коррекцией Йейтса на непрерывность выборки), либо точным двусторонним критерием Фишера, сравнивая распределение генотипов и аллелей по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролей.

Показатели «отношения шансов» (OR-odds ratio) с 95% доверительным интервалом (95% CI) рассчитывались для «редкого» аллеля, носителей «редкого» аллеля (гетерозигот + гомозигот по «редкому» аллелю) относительно «частых» аллелей и гомозигот по «частому» аллелю соответственно. Аналогичный расчёт проводился для гомозигот по «редкому» аллелю относительно гетерозигот и гомозигот по «частому» аллелю.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Процент гетерозиготного генотипа для ММР9 (82A>g) был выше среди здоровых детей (46,6% против 23,3% у пациентов с хроническим бронхитом, Padj=0,0033, Pcor =0,033, отношение шансов (OR)=0,51 локус был связан с хроническим бронхитом в аддитивной модели (Padj=0,0091, Pcor=0,09, OR=0,45, р=-0,798). Локус, А гена MMP12 встречался в группе больных в 88,33% по сравнению с 76,66% в группе здоровых, что может говорить о возможном риск-факторе этого аллеля в развитии бронхита.

Отмечено увеличение части гомозиготных носителей, А аллеля гена ММР12 (82A4G) у детей с хроническим бронхитом. Проводя параллели с данными других исследований, обнаружено, что аллель ММР12 (82A4G) имеет более высокую аффинность к фактору транскрипции AP-1, что приводит к более высокому уровню экспрессии гена [6]. АА генотип ММР12 (82A4G) был связан со снижением дыхательной функции (объем форсированного выдоха за 1 с) у взрослых курильщиков [7]. Другой функциональный ММР12 полиморфизм, 1082A4G (rs652438) были связаны с тяжестью астмы и COPD [8]. ММР12 действует в качестве важного регулятора воспаления и ремоделирования дыхательных путей в развитии аллергического воспаления, способствуя более тяжелым клиническим проявлениям астмы с частыми приступами [9]. Мы полагаем, что лечение ММР12 ингибирующими препаратами может быть перспективным подходом в терапии бронхиальной астмы. Наши данные свидетельствуют о том, что ММР12 более сильно вовлечен в патогенез не только бронхиальной астмы, но и детского хронического бронхита неаллергической природы. Тем не менее, более всесторонние исследования на больших количествах образцов позволят сделать более точные выводы.

Сравнительные исследования полиморфизма гена ММр12 в группе больных хроническим бронхитом и здоровых детей показали увеличение гомозиготных АА генотипов полиморфизма A82G гена матричных металлопротеиназ MMP12, что свидетельствуют о том, что ММР12 вовлечён в патогенез не только бронхиальной астмы, но и детского хронического бронхита.

ВЫВОДЫ

Воспалительный процесс играет центральную роль в патогенезе хронических заболеваний органов дыхания, так как является основной причиной всех функциональных и морфологических изменений. Нарушение регуляции воспалительного процесса является причиной патологического повреждения тканей лёгких. Повышенная активность ММР12 семейства матричных металлопротеиназ играет важную роль в различных заболеваниях дыхательных путей, поражающую лёгочную ткань и альвеолярные структуры. Дисрегуляции могут способствовать патология хронических заболеваний бронхолегочной системы, такие, как астма, эмфизема легких, ХОБЛ, бронхолегочная дисплазия и кистозный фиброз, острый респираторный дистресссиндром и респираторный дистресс-синдром новорождённых.

Перспективность дальнейших исследований Полученные результаты генотипирования и анализа генетической ассоциации позволят разработать доступный для практического врача алгоритм выявления группы риска, у которой высока вероятность возникновения хронического бронхита. Кроме того, будет разработан комплекс мероприятий целенаправленной профилактике хронического бронхита.

Определение генетических факторов риска развития хБ позволит обоснованно планировать и внедрять лечебно-профилактические мероприятия. Внедрение комплекса организационных, медикосоциальных, профилактических мероприятий c учётом генетических факторов позволит управлять риском развития ХБ у детей. Реализация «стратегии генетического риска» на основе разработанных генетических критериев формирования групп повышенного риска развития хронического бронхита будет способствовать раннему выявлению и лечению заболевания, что значительно улучшит его прогноз.

• 1. Genomewide linkage analysis of quantitative spirometric phenotypes in severe early-onset chronic obstructive pulmonary disease / E. K. Silverman, L. J. Palmer, J. D. Mosley [et al.] // American Journal of Human Genetics. — 2002. — Шо. 70(5). — P. 1229−1239.
• 2. BOOST: a fast approach to detecting gene-gene interactions in genome-wide case-control studies / P. Wang, M. Dai, W. Xuan, [et al.] // American Journal of Human Genetics. — 2010. — No. 87(3). — P.325−340
• 3. SNP Function Portal: a web database for exploring the function implication of SNP alleles / P. Wang, M. Dai, W. Xuan [et al.] // Bioinformatics. — 2006. No. 22(14). — P. e523-e529
• 4. Opportunities and Challenges in the Genetics of COPD 2010 / E. K. Silverman, J. Vestbo, A. Agusti [et al.] // An International COPD Genetics Conference Report. COPD. — 2011 — No. 8(2). — P. 121−135.
• 5. Genomics of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD); Exploring the SNPs of Protease-Antiprotease Pathway / M. Kumar,

N. Phougat, S. Ruhil [et al.] // Current Genomics. — 2013. — Vol. 14(3). — P. 204−213.

• 6. Role of matrix metalloproteinases in the development of airway inflammation and remodeling / V. Lagente, B. Manoury, S. Nenan [et al.] // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. — 2005.No. 38(10). — P. 1521−1530.
• 7. MMP12, lung function, and COPD in high-risk populations / G. M. Hunninghake, M. H. Cho, Y. Tesfaigzi [et al.] // New England Journal of Medicine. — 2009. — No. 361(27). — P. 2599−2608.
• 8. Matrix metalloproteinase-12 is a therapeutic target for asthma in children and young adults / S. Mukhopadhyay, J. Sypek, R. Tavendale [et al.] // Journal of Allergy and Clinical Immunology.2010. — No. 126(1). — P. 70−76.
• 9. Mocchegiani E. Metalloproteases / anti-metalloproteases imbalance in chronic obstructive pulmonary disease: genetic factors and treatment implications / E. Mocchegiani, R. Giacconi, L. Costarelli // Current Opinion in Pulmonary Medicine. — 2011. — No. 17. — P. S11-S19.