Повышение разрешающей способности дифференциального окрашивания хромосом

Методика задержки конденсации митотических хромосом была апробирована для повышения разрешающей способности ORи С-бэндинга хромосом разных размеров у высших растений (лен, ромашка, горох, цингерия). Кроме того, использование 9-АМА впервые дало возможность визуализировать и исследовать с помощью светового микроскопа хромосомы одного из самых примитивных низших растений — красных одноклеточных водорослей. Установлено, что для всех исследованных объектов оптимальной является одна и та же концентрация 9-АМА — 0,5−1 мкг/мл. Все изложенное позволяет рекомендовать использование этого интеркалятора для получения высокоразрешающего дифференциального окрашивания как хромосом растений, так и человека и животных.

Определение оптимальных для исследования интервалов длин недоконденсированных хромосом, полученных после предобработки 9-АМА.

Использование 9-АМА впервые позволило идентифицировать мелкие хромосомы льна посевного (Linum usitatissimum L.) по рисункам С-окраски повышенного разрешения. При проведении этой работы, мы столкнулись с тем, что применение 9-АМА значительно увеличивает вариабельность метафаз по степени конденсации хромосом на препаратах, что особенно заметно для мелких хромосом (Рис. 2).

Рис. 2. С-дифференциальное окрашивание хромосом льна (L. usitatissimum L.): а — метафазная и б — прометафазная пластинки.

Это побудило нас осуществить исследование достоверности оценки размеров и положения С-бэндов на «удлиненных» хромосомах. Сравнение вариабельности рисунка С-окраски в зависимости от степени конденсации хромосом было проведено на примере хромосомы 4 льна крупноцветкового (Linum grandiflorum Desf.), содержащей относительно небольшое число С-бэндов. Препараты хромосом льна были приготовлены в двух вариантах: по стандартной методике с использованием колхицина и по предложенной нами методике с использованием 9_АМА (1мкг/мл на 12 часов перед фиксацией).

Для сравнения была взята хромосома 4 ячменя (Hordeum vulgare L.) (Рис. 3). Ячмень был выбран потому, что для этого объекта был предварительно проведен качественный и количественный анализ полиморфизма С-блоков хромосом, и на основе полученных сведений были разработаны основные принципы хромосомной паспортизации по рисункам С-окраски.

Оказалось, что, несмотря на значительно больший разброс длин хромосомы 4 льна (2,3−7,1 мкм), после обработки 9-АМА по сравнению с необработанными (1,5−2,8 мкм) (Рис. 4), основной рисунок С-окраски мало изменяется. При длине хромосомы от 2,3 до 5,5 мкм обнаружено постоянство размеров и вариабельности крупных гетерохроматических блоков; не меняется также положение на хромосомных плечах небольших интеркалярных С-бэндов. Это позволяет проводить оценку полиморфизма С-блоков в хромосоме 4 льна, подобно тому, как это делается и у ячменя.

Рис. 4. Функция распределения длин хромосом ячменя (1), льна после обработки 9-АМА (2), льна без обработки 9-АМА (3).

Таким образом, было установлено, что на препаратах, приготовленных с применением 9-АМА, необходимо выбирать для исследования определенный интервал длин хромосом, который не должен превышать трёх средних размеров тех же метафазных хромосом, полученных без применения интеркалятора. В этом интервале длин можно достоверно оценивать хромосомный полиморфизм как по наличию-отсутствию С-бэндов, так и по их размерам. В указанном интервале длин на мелкохромосомных объектах можно проводить сравнительные исследования рисунков С-окраски и составлять хромосомные паспорта, аналогично тому, как это делается на крупнохромосомных объектах. Рекомендации, приведенные в этом разделе, учитывались нами при изучении полиморфизма по С-блокам разных сортов посевного льна (долгунцовые, масличные и межеумки) и в последующих исследованиях хромосом растений с использованием 9-АМА.